小鼠cofilin-1基因及其真核表达载体的构建与体内外表达

李玲玲，张 伟，杜 蕊，宋玲珍，柴学军，胡新德，陈树林，赵善廷

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg,Freiburg 79104,Germany)

运动是生命细胞的基本特征之一。对大多数细胞而言，其运动能力离不开肌动蛋白、肌球蛋白以及一些调节蛋白对微丝和微管的调节作用。肌动蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor，ADF)/Cofilin家系成员之一的丝切蛋白(Cofilin)，是普遍存在于真核生物中的一种低分子质量的肌动蛋白结合蛋白，它通过结合和剪切F-肌动蛋白(F-actin)，改变F-actin骨架结构，发挥调节细胞定向运动的功能，在细胞趋化、迁移中发挥关键作用[1-4]。Cofilin的活性通过磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇化、pH改变等方式进行调节，其中磷酸化与去磷酸化是Cofilin响应胞内外刺激信号改变最重要的调节方式。Cofilin失活可引发多种疾病，如癌症、阿尔兹海默症、局部缺血性肾病等[5]。

哺乳动物cofilin基因有2种亚型：cofilin-1和cofilin-2，分别编码不同的蛋白。cofilin-1 (cfl1)在多种非肌肉组织中表达，特别是在脑和肝脏中；而cofilin-2主要在肌肉组织中表达。研究发现，ADF-/-敲除小鼠胚胎可以成活[6]，并完成正常的胚胎发育，而cfl1-/-敲除小鼠胚胎不能正常成活，胚胎于9.5 d死亡[7]。cfl1-/-脑特异性敲除小鼠的大脑皮层细胞迁移和细胞周期均受到影响，表明在小鼠胚胎发育过程中大脑皮质神经元的迁移离不开cfl1的调节作用[8]。

研究表明，Cofilin N端第3位丝氨酸磷酸化后，使Cofilin无法与肌动蛋白结合，失去解聚功能[9]；相反，p-Cofilin去磷酸化使Cofilin活化[10]。第3位丝氨酸突变为S3A可使Cofilin不被磷酸化，始终处于活化状态；S3E或S3D的突变则使Cofilin类磷酸化，Cofilin始终保持失活状态[11]。

体外试验表明，Cofilin过表达[12-13]或Cofilin Ser 3位点点突变可引起细胞运动障碍[14- 15]，但Cofilin-1 (Cfl1)及其Ser 3位点磷酸化在神经元迁移中的作用机制仍不清楚。为了进一步研究Cfl1在神经元迁移中的作用机制，本试验以小鼠的cfl1基因为研究对象，经点突变技术，构建Cfl1的野生型、持续活化型和持续失活型真核表达载体，通过细胞转染和mRNA半定量检测,体外观察其表达情况，并利用活体原位电转的方法在鸡胚脊髓神经元中检测其表达情况，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

昆白系小鼠，购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心；种鸡蛋购自陕西杨凌种鸡厂；大肠杆菌感受态细胞Trans5α、克隆载体pEASY-T1 Simple、Trans2K DNA Marker、Trans5K DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自Promega公司；Platinum®TaqDNA Polymerase High Fidelity、M-MLV cDNA合成试剂盒、LipofectamineTM2000、Trizol试剂、Rabbit-anti-GFP、Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568，均购自Invitrogen Life Technologies；胎牛血清，购自Hyclone公司；D-MEM/F-12、Opti-MEM，购自Gibco公司；TRITC-conjugated Phalloidin、DAPI，购自Millipore公司；Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody，购自Santa Cruz公司。CHO细胞系、pCAG-MCS-myc和pCAG-EGFP载体为本实验室保存；引物合成(PAGE纯化方式)及测序工作由生工生物(上海)有限公司完成。

1.2 小鼠cfl1基因的克隆与分析

1.2.1 小鼠cfl1基因的克隆 根据小鼠cfl1基因的CDS区序列(GenBank序列号NM_007687)，用DNAMan软件设计包括整个基因阅读框的特异性引物F/P1和R/P1(表1)。取成年小鼠大脑组织提取RNA，反转录获得总cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F/P1 0.75 μL，R/P1 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O补足25 μL。反应程序如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共32个循环；68 ℃后延伸5 min。将扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，与pEASY-T1 Simple载体于室温下连接后，转化大肠杆菌感受态细胞Trans5α，经菌液PCR、酶切及测序鉴定后保留阳性克隆，将其命名为pEASY-T1-cfl1。

表 1 试验用所引物及其序列

1.2.2 不同物种cfl1基因编码蛋白的生物信息学分析 通过NCBI(Bethesda，MD,USA,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共数据库查找不同物种Cofilin蛋白的氨基酸序列，并利用UniPro (http://www.uniprot.org/)获得氨基酸序列的主要结构域和关键位点信息，通过DNAman version 5.2.2 (Lynnon Biosoft Company，USA)进行多序列比对分析。

1.3 cfl1基因真核表达载体的构建

采用经引物引入点突变的方法，参考靶基因cfl1的阅读框，用DNAMan软件设计3条上游引物，依次为F/P2、F/P3、F/P4(表1)，分别用于野生型、活化型和失活型Cfl1 3种真核表达载体的构建。F/P2、F/P3、F/P4 3条上游引物的5′端引入EcoRⅠ酶切位点，同时加保护性碱基(Kozak序列)以增强目的片段的转录；下游引物为公用的R/P，其5′端引入BglⅡ酶切位点，同时补加碱基以防止移码突变。以1.2.1节构建的质粒pEASY-T1-cfl1为模板，利用高保真聚合酶进行PCR扩增。用EcoRⅠ和BglⅡ对回收的目的片段和真核表达载体pCAG-MCS-myc双酶切，回收的目的条带经T4 DNA连接酶连接，构建pCAG-cfl1(wt)-myc(pCAG-cfl1-wt)、pCAG-cfl1(S3A)-myc(pCAG-cfl1-S3A)和pCAG-cfl1(S3D)-myc(pCAG-cfl1-S3D)3种真核表达载体(图1)。转化大肠杆菌感受态细胞Trans5α，经菌液PCR、EcoRⅠ/BglⅡ双酶切及测序鉴定后保留相应阳性克隆。

1.4 小鼠cfl1在细胞中表达的半定量分析

1.4.1 细胞培养及转染 将CHO细胞接种到含体积分数10%胎牛血清和青链霉素 (100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素)的DMEM/F12((DMEM与F12体积比为1∶1)培养基中，将培养皿置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养，当细胞融合度达到70%～90%时，参照LipofectamineTM2000的使用说明，用pCAG-MCS-myc、pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D转染细胞，以未转染质粒的正常CHO细胞作为对照(Control)。

1.4.2 Cfl1 mRNA表达量的半定量RT-PRC分析 将真核重组质粒转染的CHO细胞培养24 h后提取总RNA，备用。设计半定量引物F/P5和R/P5(表1)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，检测重组质粒的表达能力。以总RNA为模板，反转录获得cDNA，反应体系为：总RNA 2.5 μg，5×Reaction Buffer 4 μL,OligodT 2 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RT-Enzmye 1 μL，用DEPC水补足20 μL体系。以反转录产物为模板，进行目的片段的扩增，反应体系为：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F/P5 0.75 μL，R/P5 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O补足25 μL体系。反应程序如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共30个循环；68 ℃后延伸5 min。取PCR产物20 μL进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

图 1 pCAG-cfl1-myc真核表达载体的构建原理

1.4.3 细胞爬片的免疫荧光染色 制备CHO细胞爬片，待细胞融合度达到25%～40%时，根据LipofectamineTM2000使用说明用pCAG-cfl1的3种真核表达载体转染CHO细胞，24 h后，爬片经40 g/L多聚甲醛固定、体积分数0.1% Triton X-100透化、体积分数1% BSA封闭，各步间漂洗用0.1 mol/L PBS。F-actin经TRITC-conjugated Phalloidin (体积比1∶4 000)室温染色2 h，经PBS漂洗后，用DAPI (体积比1∶500)标记细胞核。用抗荧光淬灭剂(Dako)将漂洗后的爬片固定在载玻片上，晾干后置于结构照明显微镜Axio Observer Z1(蔡司)下，观察重组质粒在细胞中的表达情况。

1.5 小鼠cfl1基因在鸡胚脊髓中的表达

1.5.1 pCAG-cfl1的鸡胚活体原位电转 在37 ℃、相对湿度65%条件下对种蛋进行孵化，在胚胎发育第3天(E3)取出鸡胚，侧面开直径2～3 cm大小的孔，在体视显微镜下，使用毛细管注射针将pCAG-cfl1的3种质粒分别与pCAG-EGFP按4∶1体积比配制的工作液0.1～0.5 μL准确注射到脊髓腔，将针状电极置脊椎两侧，确保电极与组织之间有一定空隙，使用BTX ECM830电转仪进行电转，电转电压18 V，每次电击60 ms，间隔100 ms，电脉冲6次，整个过程在无菌操作工作台内完成，以pCAG-EGFP转染脊髓作为对照(Control)。转染后3 d取出，在显微镜下观察结果，电转部位呈现绿色荧光者(绿色荧光蛋白GFP的颜色)视为阳性。

1.5.2 鸡胚切片的制备 在倒置体视显微镜下观察阳性表达的胚胎。在倒置体视显微镜下，用尖头镊子划破卵黄膜，取出整个胚胎，转移至4 ℃多聚甲醛中，在摇床上固定3 d，取出组织，吸干液体，用40 g/L琼脂糖包埋， 注意方向，头朝上，确定好位置，在Leica全自动振荡切片机上连续切片，切片厚度为80 μm，置于含体积分数0.1% NaN3的0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PB)中于4 ℃下保存。

1.5.3 组织切片的免疫荧光染色 将组织切片从4 ℃冰箱中取出，用0.1 mol/L PB漂洗3次，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody、Rabbit-anti-GFP 4 ℃过夜孵育组织切片，PB漂洗后，分别用Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568 4 ℃过夜孵育。经PB漂洗后，用DAPI(体积比1∶500)标记细胞核。用抗荧光淬灭剂(Dako)将漂洗后的组织切片固定在载玻片上，晾干后置于结构照明显微镜Axio Observer Z1下，观察重组质粒在神经元中的表达情况。

1.6 统计分析

将转染后的组织切片经免疫荧光染色后，在结构照明显微镜Axio Observer Z1下拍照。在照片中荧光较强的部位选取200 μm×200 μm大小的面积，通过ImgeJ对转染神经元进行计数。利用GraphPad Prism 5.0软件对转染神经元的统计数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 不同物种Cfl1蛋白的氨基酸序列比对

小鼠Cfl1蛋白是由166个氨基酸编码的蛋白质。氨基酸多序列比对结果见图2。

图 2 不同物种Cofilin-1 (Cfl1)蛋白的氨基酸序列比对结果

图2显示，小鼠与人类Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性为98.8%，与原鸡的Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性为81.3%，与非洲爪蟾Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性为77.3%。不同物种的Cfl1蛋白肌动蛋白和肌球蛋白的结合区域相似度较高，关键区域的保守性较高，如与Cfl1磷酸化状态相关的S3位点以及核定位信号 K30-K34等。

2.2 cfl1基因重组真核表达载体的鉴定

经PCR扩增，获得cfl1的CDS序列，构建出pEASY-T1-cfl1重组克隆质粒。以构建的pEASY-T1-cfl1重组克隆质粒为模板，利用加有酶切位点和特定位点点突变的引物进行PCR扩增，获得cfl1的不同突变体(Cfl1-wt、Cfl1-S3A、Cfl1-S3D)，其经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，出现大约520 bp的片段(图3-A)，与预期条带大小相符。用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切回收产物和pCAG-MCS-myc，依次构建真核重组表达载体pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D，限制性酶切产物中均出现了5 200 bp左右的载体骨架和500 bp左右的插入片段(图3-B)，与预期结果一致。真核重组表达载体的测序结果显示，本试验成功构建了Cfl1野生型的表达载体pCAG-cfl1-wt及Cfl1的磷酸化及去磷酸化突变载体pCAG-cfl1-S3D和pCAG-cfl1-S3A。野生型Cfl1的第3个氨基酸是丝氨酸(S)，密码子是UCU；Cfl1的类磷酸化突变体第3位是天冬氨酸(D)，密码子是GAU；Cfl1的去磷酸化突变体第3位是丙氨酸(A)，密码子是GCU(图3-C)。

图 3 cfl1基因重组真核表达载体的构建与区分

2.3 cfl1基因重组质粒在CHO细胞中的表达检测

重组质粒转染CHO细胞24 h后，提取总RNA，利用半定量RT-PCR检测构建质粒表达的强弱。由图4-A可以看出，对照组细胞与转染空载体pCAG-MCS-myc的Cfl1 mRNA表达无明显差异；处理组pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D的Cfl1 mRNA表达均比转染pCAG-MCS-myc的细胞强。采用GraphPad Prism 5.0软件对采集到的灰度值进行分析，其结果与半定量RT-PCR结果一致。由图4-B可知，转染重组质粒的CHO细胞中，Cfl1 mRNA表达量较对照明显升高，说明转染的能够表达Cfl1的质粒正确表达了Cfl1蛋白；同时，转染pCAG-cfl1-wt与pCAG-cfl1-S3A的CHO细胞对Cfl1 mRNA表达无显著差异，而转染pCAG-cfl1-S3D的CHO细胞对Cfl1 mRNA的表达较pCAG-cfl1-wt和pCAG-cfl1-S3A明显增强。

将转染重组质粒的CHO细胞爬片进行免疫荧光染色，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody对重组质粒表达的融合蛋白进行标记，观察到重组质粒在CHO细胞中可正常表达，且融合蛋白的表达量较高(图4-C)。

图 4 cfl1基因重组质粒在CHO细胞中的表达

用TRITC-conjugated Phalloidin对F-actin进行标记，正常CHO细胞呈不规则形，胞体较大，胞浆丰富，轮廓清楚，细胞核卵圆形，位于胞质中央，细胞密集时呈长梭形，无伪足或伪足较少，细胞稀疏时伸出伪足，标记的F-actin位于细胞质及伪足中(图5-a，b)。在转染pCAG-cfl1-wt的CHO细胞中，伪足均匀分布在细胞周围，且F-actin较长(图5-c)；在标记myc后，可观察到重组质粒所表达的融合蛋白分散在细胞核周围，且存在点状分布，在细胞周围的伪足中均有分布，大部分与F-actin重合[16](图5-d)。在转染pCAG-cfl1-S3A的细胞中，可观察到细胞周围的微丝呈簇状分布(图5-e)，且分布位置集中在融合蛋白表达较强的部位(图5-f)；而在转染pCAG-cfl1-S3D的细胞中，转染细胞的微丝分布无明显变化(图5-g,h)，其对肌动蛋白的影响有待进一步研究。

图 5 Cfl1超表达对CHO细胞肌动蛋白(F-actin)的影响

2.4 cfl1基因重组质粒在鸡胚脊髓中的表达检测

对采集的GFP阳性材料进行切片，在体视显微镜下挑出绿色荧光表达较强的切片进行免疫荧光染色，在倒置荧光显微镜下观察，结果均检测到了构建质粒的表达(图6-A)，其中对照组荧光染色图为转染等浓度pCAG-EGFP的鸡胚脊髓图。为了验证构建质粒在神经元中表达的高效性，利用ImgeJ对所选区域目的质粒表达阳性的神经元进行计数，采用GraphPad Prism 5.0软件对采集到的数据进行统计，t检验结果表明，在所选取的相同面积内，pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D与等浓度GFP转染神经元的个数无明显差异 (图6-B)，证明了重组质粒在神经元中表达的高效性。

3 讨 论

Cofilin是肌动蛋白结合蛋白，是中枢神经系统中主要的肌动蛋白解聚因子。在小鼠胚胎发育第10天(E10)，cfl1开始在神经管中表达，从胚胎发育第13天(E13)开始，cfl1在中枢神经系统中的表达明显增强，一直维持到小鼠出生，然后有所下降[7-8]，而胚胎发育第13天至小鼠出生正是大脑神经元产生和迁移的时期，这表明cfl1与神经元迁移有着密切的关系。cfl1基因敲除会导致胚胎发育严重异常，所有胚胎都在胚胎发育中后期死亡(E10～E19)，胚胎发育障碍的主要表现之一是神经管未闭合，神经系统不能发育[17]，表明cfl1对中枢神经系统的发育至关重要。

图 6 cfl1基因重组质粒在鸡胚脊髓神经元中的表达

然而，cfl1在体内神经系统中的研究相对困难，导致了cfl1在神经元迁移中的作用机制尚不明确。为此，笔者在试验中采用了活体原位电转基因技术。它能够将重组质粒转入神经元中，是体内研究功能基因的有效方法之一。在电转过程中，由于质粒带负电荷使其向正极方向移动，可瞬时进入细胞，利用表达载体自身的系统进行蛋白质的合成，能够很直观地检测目的蛋白的表达情况以及对转染细胞的影响。该方法为进一步研究Cofilin-1在神经系统发育过程中对神经元迁移的影响提供了技术保障。

此外，Cofilin是普遍存在于真核细胞的一种肌动蛋白结合蛋白，当外源转染能够表达Cofilin的重组质粒时，必须保证能够有效地区分内、外源Cofilin。因此，本试验中使用了带有常规抗原标签c-Myc的真核表达载体pCAG-MCS-myc作为载体骨架。c-Myc是一种常用的短肽标签，不仅有利于对重组蛋白检测，而且不会影响目的蛋白的理化性质[18]。根据这一点，经免疫荧光染色即可区分外源表达的Cofilin蛋白。

经过CHO细胞转染和鸡胚脊髓电击转染的检测，证明本研究所构建的pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D 3种真核表达载体在体外和体内都能够高效表达，为进一步探讨Cofilin-1对神经元的调控机制奠定了基础。

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