玫烟色棒束孢IF-1106菌株培养条件研究

田晶，梁丽，孟豪，郝赤，马瑞燕

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)以前称为玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)，属于半知菌亚门(Deuteromycotian)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Moniliales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、棒束孢属(Isaria)，分布广泛，能寄生同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等多种有害昆虫,是一种重要的昆虫病原真菌[1]。20世纪90年代以来国外就玫烟色棒束孢的生物学、分类、遗传变异、代谢产物、致病性测定等方面进行了大量研究，在欧洲玫烟色棒束孢已商品化且用于防治烟粉虱[2～6]。国内的研究工作主要集中在玫烟色棒束孢菌株的生物学特性及致病性测定等方面，吴伟等对玫烟色棒束孢不同菌株的培养条件进行了研究[7～9]，黄振等测定了玫烟色棒束孢对烟粉虱、桃蚜等的致病力[10～12]。

2011年在山西省太谷县温室大棚中分离鉴定到一株玫烟色棒束孢菌株，命名为IF-1106，通过初步实验证明该菌对烟粉虱等害虫有较高的致病力[13]，因此可用该生防菌防治害虫。李昌农等[14]报道培养条件对菌株的产孢量及致病力均有较大影响，且产孢量是筛选优良菌株的重要指标[13]。此外，不同菌株的生物学特性之间有所差异[7～9]。因此，了解影响该玫烟色棒束孢菌株菌落生长及产孢的环境因子，是利用该菌防治害虫的基础。

本文以菌落直径和产孢量为指标，对玫烟色棒束孢IF-1106菌株室内平板培养的最适培养基配方、温度、pH、光照条件和通气条件进行了初步筛选，明确该菌株培养的最适条件，以期为该菌的大量生产提供理论依据，为进一步利用该菌进行研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

玫烟色棒束孢IF-1106菌株，试管斜面保存于4℃冰箱中。使用时，取出活化，接种于PDA培养基上，置于25℃霉菌培养箱中培养。

1.2 生物学指标测定方法

1.2.1 菌落生长速率测定

挑取斜面菌种的分生孢子，接入已经灭菌的0.1%的吐温80溶液中，用血球计数板将孢子浓度调整为1.0×107孢子·mL-1，制成孢子悬浮液。用灭菌的滤纸片(直径6 mm)蘸取孢子悬浮液，置于每皿25 mL培养基的平板中心，25℃条件下黑暗培养。每个处理重复5次，从第3 d开始每隔2 d定时、定向测量菌落直径，共测5次，计算生长速率(mm·d-1)，同时观察菌落形态特征。

1.2.2 产孢量的测定

在第5次测量菌落直径后，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温80打散，放在磁力搅拌器上搅拌30 min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数。

1.3 培养条件设置

1.3.1 培养基配方

马铃薯葡萄糖培养基(PDA):土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L。

马铃薯蔗糖培养基(PSA): 土豆200 g，蔗糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L。

萨氏葡萄糖培养基(SDA):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。

萨氏葡萄糖酵母浸膏培养基(SDAY):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，酵母粉2 g，蒸馏水1 L。

萨氏麦芽糖酵母浸膏培养基(SMAY):蛋白胨10 g，麦芽糖40 g，琼脂15 g，酵母粉2 g，蒸馏水1 L。

察氏培养基(Czperk):NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L。

菌株接种于以上各种培养基上，于25℃恒温培养箱中全黑暗培养，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。

1.3.2 温度

菌株接种于PDA培养基上，分别于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的霉菌培养箱中全黑暗培养，每个温度设5次重复，各生物学指标测定同1.2。

1.3.3 光周期

菌株接种于PDA培养基上，于25℃下设24 L、16 L/8 D、12 L/12 D、8 L/16 D、24 D 5个光周期培养。每个处理设5次重复，各生物学指标测定同1.2。

1.3.4 通气

菌种接种于PDA培养基上，于25℃下培养。将接好菌的培养皿分别用Parafilm(美国，PM-996)封口膜(裁成3 cm的宽度)封口、家用保鲜膜(裁成3 cm的宽度)封口、不封口，共3个处理，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。

1.3.5 初始pH

用NaOH和乳酸调节PDA培养基pH值分别为5、6、7、8、9，然后接种于25℃条件下进行培养，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。

1.4 数据处理

用SPSS17.0数据处理系统对实验数据进行统计分析，计算均值及标准误，均值差异显著性通过Duncan新复极差法进行多重比较分析。回归方程用SPSS线性回归分析得出，回归方程斜率即为菌落生长速率。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响

玫烟色棒束孢在6种不同培养基上的菌落直径(F=69.40; df=5,24; P<0.001)及产孢量(F=55.40; df=5,24; P<0.001)不同(表1)。在SMAY培养基上，菌落生长与其他处理差异显著，菌丝生长最快，菌落直径最大，为36.9 mm，但该菌株的产孢量却较低。玫烟色棒束孢在PDA培养基上的产孢量与其他处理差异显著，产孢量最大，达1.91×107孢子·mL-1。

2.2 不同光照对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响

在不同的光周期下，菌落直径(F=127.1; df=4,20; P<0.001)及产孢量(F=5.832; df=4,20; P=0.003)有一定差异(表2)。24 h全光照条件下，菌落直径最大，为48.8 mm；生长速率最快，为4.627 mm·d-1。在全黑暗条件下，菌落的产孢量最大，为1.992×107孢子·mL-1。随着光照时间的延长，菌落直径呈逐渐增大趋势，但菌落的产孢量逐渐下降。

另外，在全光照条件下菌落较薄，绒毛状菌丝较少，菌落较光滑，玫烟色较深；在光暗交替下，菌落有明显的同心轮纹，在12 L/12 D条件下同心轮纹均匀；在全黑暗条件下，菌落绒毛状菌丝较多，菌落较厚。

表1 不同培养基上玫烟色棒束孢IF-1106菌株菌落直径及产孢量

注：经Duncan多重比较，表中同列英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著，表2～表5同。

Note：Means in the same column followed by the same letters are not significantly different, P>0.05.The same with Table 2 to Table 5.

表2不同光周期下玫烟色棒束孢菌落直径及产孢量

Table2 The effect of photoperiods on mycelia diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

光周期Photoperiods菌落直径Diameter ofmycelial/mm生长回归方程Regression equation(Y=b+aX)相关系数(R2)Correlation coefficient产孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-124L48.76±0.19aY=-1.405+4.627X0.9961.063±0.142c16L/8D38.76±0.34bY=4.953+3.121X0.9691.335±0.122bc12L/12D39.08±1.15bY=3.130+3.346X0.971.803±0.907ab8L/16D35.68±0.40cY=7.018+2.678X0.971.867±0.251a24D30.58±0.33dY=5.947+2.343X0.9591.992±0.165a

2.3 不同温度对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响

玫烟色棒束孢在15～30℃的范围内均可生长，在不同温度下，菌落直径(F=113.0; df=3,16; P<0.001)及产孢量(F=69.94; df=3,16; P<0.001)有一定差异(表3)。在30℃时菌落直径最大，培养11 d后菌落直径达33.0 mm，在25℃时菌丝生长速率和产孢最大，分别为2.486 mm·d-1和1.910×107孢子·mL-1。

2.4 不同通气条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响

玫烟色棒束孢菌株在平板培养过程中，封口和未封口的培养皿的菌落直径(F=1.402; df=2,12; P=0.284)差异不显著，产孢量(F=8.030; df=2,12; P=0.006)有一定差异(表4)。在不封口情况下，菌落生长较快，菌落直径最大，为35.8 mm，且菌落生长速率最快，为2.841 mm·d-1，产孢量也较大，为4.56×106孢子·mL-1。

表3不同温度下玫烟色棒束孢IF-1106菌株菌落直径及产孢量

Table3 The effect of temperatures on mycelial diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

温度Temperature/℃菌落直径Diameter of mycelial/mm生长回归方程Regression equation(Y=b+aX)相关系数(R2)Correlation coefficient产孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-110不生长1522.18±0.33cY=1.860+1.864X0.9890.314±0.014c2028.94±0.13bY=4.315+2.339X0.9571.245±0.049b2529.14±0.59bY=3.142+2.486X0.9391.910±0.168a3033.04±0.92aY=6.123+2.471X0.9790.471±0.019c35不生长40不生长

表4不同通气条件下玫烟色棒束孢IF-1106菌株菌落直径及产孢量

Table4 The effect of ventilation conditions on mycelial diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

通气条件Ventilation菌落直径Diameter of mycelial/mm生长回归方程Regression equation(Y=b+aX)相关系数(R2)Correlation coefficient产孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-1保鲜膜封口33.82±0.53aY=5.768+2.600X0.9790.334±0.017bParafilm膜封口34.82±1.33aY=6.327+2.727X0.9480.368±0.008b不封口35.84±0.37aY=5.750+2.814X0.9680.456±0.033a

2.5 不同初始pH条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响

玫烟色棒束孢在初始pH值为5～10的范围内均可生长和产孢，但不同初始pH条件下的菌落直径(F=63.15; df=5,24; P<0.001)及产孢量(F=62.83; df=5,24; P<0.001)有一定差异(表5)。初始pH值为7时，菌落直径及产孢量最大，分别为36.9 mm和5.69×106孢子·mL-1，在初始pH值为7条件下菌落生长速率最快，为3.347 mm·d-1。随着初始pH值的升高或降低，菌落直径及产孢量逐渐减小。

表5 不同初始pH条件玫烟色棒束孢IF-1106菌株菌落直径及产孢量

3 结论与讨论

玫烟色棒束孢最适培养基为PDA培养基。玫烟色棒束孢在6种试验培养基上均可产孢，说明该菌对营养的需求较低，对碳源要求不高，可利用葡萄糖、蔗糖及麦芽糖，氮源既可利用有机氮也可利用无机氮，可见玫烟色棒束孢易于大规模培养。

温度是影响菌株生长的重要因子之一[15]。不同地理来源的菌株，其生长和产孢的温度范围不同，根据代表温带、亚热带和热带地区37个玫烟色棒束孢菌株生物学特性研究，欧洲菌株的生长最适温度为20～25℃，美国和西亚菌株的生长最适温度为25～28℃，来自印度季风气候区的菌株最耐高温，在32～35℃高温下仍然生长[15]。试验菌株在15～30℃的范围内可以生长和产孢，30℃条件下菌落生长最快，但25℃条件下产孢较多，因此生长所需温度比产孢高。

光周期对玫烟色棒束孢菌落的生长和产孢均有一定影响。从试验中可以得出，光照可以促进菌落生长但会抑制产孢。雷妍圆[16]研究表明随着光照时间的延长，菌落生长速率有所增加，但产孢量有所下降。该结果与其一致。光照可以促进菌落生长，此时该菌的营养生长旺盛，但是却抑制了菌的生殖生长，造成产孢量的下降。因此可以考虑在培养前期给予一定的光照，先让其进行营养生长，至后期再转为全黑暗培养以利于其产孢。

不封口的情况下玫烟色棒束孢菌丝生长比封口情况相对较好，而且不封口的情况下产孢量较大。用2种封口材料封口后，对菌株的生长和产孢的影响无显著差异，因此若在一些特定条件下需要封口培养，可用家用保鲜膜封口以节约成本。

酸碱度对玫烟色棒束孢菌落的生长和产孢也有影响。pH值为7时最适合玫烟色棒束孢生长和产孢。

综上所述，玫烟色棒束孢最适培养条件为：初始pH值为7的PDA培养基，25℃条件下全黑暗、不封口培养。

参 考 文 献

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