岩原鲤染色体核型分析

徐 滨，朱祥云，魏开金，马宝珊

(中国水产科学研究院 长江水产研究所；农业部淡水生物多样性保护重点实验室，湖北 武汉 430223)

岩原鲤，地方名岩鲤巴、岩鲤、黑鲤。20世纪30年代张春霖对岩原鲤进行了形态学研究，将其命名为Procyprisrabaudi(Tchang)，其后林书颜建立了原鲤属[1]，将其归于鲤形目、鲤科、鲤亚科、原鲤属，是一种栖居于长江流域江河岩石缝间的底层鱼，在宜昌以上长江水系的干支流及金沙江中上游的江河中多有分布，目前主要分布于四川境内的江河中，尤其是嘉陵江和岷江。岩原鲤鱼肉质肥嫩味道鲜美，肌间刺少，是上等的食用鱼类，深受消费者所喜爱。由于人们在长江水系中的过度捕捞(尤其是用电网捕捞), 加之长江三峡水利枢纽的兴建，长江上游水位大幅度上升，对岩原鲤的生存环境产生了很大影响，其野生资源日益枯竭。在长江上游的干流以及支流的沱江、嘉陵江、岷江、赤水河等江河中，岩原鲤现存数量极少，已濒于灭绝[2]。岩原鲤人工饲养还未形成规模，其主要原因是人工繁殖的苗种极为有限，有些地方供给饲养单位的苗种不纯，许多是利用岩原鲤的雄鱼与其他鲤鱼杂交的后代作为岩原鲤饲养。因此，保护岩原鲤这一优质鱼类资源及开展其人工繁殖、饲养和饵料研究工作已迫在眉睫。

染色体是遗传物质的主要载体，染色体的数目和结构决定了物种的特征，染色体核型可以反映物种的分化亲缘关系、演化途径和进化历史[3]。生物的历史记载在染色体上[4]，分析鱼类的染色体核型对于研究鱼类的遗传变异、分类地位、系统演化、性别决定和杂交育种均具有重要意义。为此，本研究利用体内注射植物血球凝集素(PHA)的肾细胞体内培养法，对岩原鲤染色体核型进行了研究，旨在了解其细胞生物学特征，从而为岩原鲤的遗传育种工作提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用岩原鲤于2012-10取自重庆市万州市水产研究所养殖基地，共50尾，体长为(28.01±1.47) cm，体质量为(516±81) g/尾。试验前暂养于长江水产研究所循环水养殖系统内，饲养用水为经颗粒活性炭等方法过滤曝气的自来水，水中溶氧(7.0±0.3) mg/L，水温(21±1) ℃，pH 7.5±0.1。

1.2 方 法

1.2.1 PHA和秋水仙素注射 参考国标GB/T 18654.12-2008[5]的方法进行试验。具体操作如下：按照厂家推荐剂量用质量分数0.7%生理盐水配制植物血球凝集素(PHA)，向岩原鲤腹腔注射PHA溶液，饲养12 h后，在同一部位腹腔注射秋水仙素溶液，剂量1.5 μg/g。注射时以30°倾斜刺入腹腔，不要插入过深，以免插到内脏造成试验鱼死亡。

1.2.2 细胞悬液的制备 注射秋水仙素4 h后，剪断鳃血管，放血后取出头肾，放入盛有3 mL质量分数0.7%生理盐水的小烧杯中，剪碎后吸出细胞悬液，1 000 r/min离心5 min收集肾细胞，加入0.075 mol/L KCl溶液37 ℃水浴低渗20 min，1 000 r/min 离心5 min后加入新制备的卡诺氏固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)室温固定20 min，重复固定3次，然后1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀，加入适量现配固定液，将细胞吹打均匀。

1.2.3 滴 片 用吸管吸取细胞悬液，在约45°倾斜的冰冻玻片上滴2～3滴，静置干燥，用质量分数10% Giemsa染液(pH=6.8的磷酸缓冲液配制)染色20 min，在室温下自然干燥后，置于显微镜下观察拍照。

1.3 核型分析

将染色体玻片置于显微镜下观察，选取50个染色体中期分裂相进行染色体计数。并选取10个清晰的中期分裂相进行显微拍照、放大和测量。染色体类型按照Levan等[6]的标准确定，即按臂比将染色体分为4 组:(1)中部着丝点染色体为m 组，臂比为≥1.00～≤1.70；(2)亚中部着丝点染色体为sm 组，臂比为>1.70～≤3.00;(3)亚端部着丝点染色体为st 组，臂比为>3.00～≤7.00；(4) 端部着丝点染色体为t 组，臂比>7.00。 m 和sm 染色体臂数为2，st 和t 染色体臂数为1。臂比=长臂/短臂，染色体相对长度=(每条染色体长度/单倍体组染色体总长度)×100。数据用Excel软件进行统计分析，结果采用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。

2 结果与分析

2.1 岩原鲤染色体数目的确定

在显微镜下对岩原鲤分散良好的50个染色体中期分裂相进行计数。结果显示，岩原鲤的染色体众数为100，占分裂相总数的78%(表1)。非众数部分的染色体数目可能是由于制片过程中染色体丢失或细胞重叠所致。通过核型分析可知岩原鲤染色体数为2n=100。

表1 岩原鲤染色体数目出现频率

2.2 岩原鲤的染色体组型

岩原鲤各染色体的类型、相对长度、臂比见表2。结果显示，岩原鲤具有50对染色体，其中11对为中部着丝点染色体(m)、13对为亚中部着丝点染色体(sm)、11对为亚端部着丝点染色体(st)、15对为端部着丝点染色体(t)。组型公式为：2n=22m+26sm+22st+30t。臂数(NF)：148。岩原鲤的中期分裂相和核型图谱见图1。

表2 岩原鲤染色体核型分析数据

图1 岩原鲤中期染色体分裂相及其核型

2.3 岩原鲤与鲤科鱼类的核型比较

由表3可知，岩原鲤与鲤亚科其他鱼类和鲃亚科部分鱼类的染色体核型2n数相同，均为100，但是核型公式和染色体臂数略有差异，可能是进化过程中该亚科鱼类染色体重排所致。因为只有通过染色体重排这种方式，才不会导致染色体数目的改变，而只引起其臂数的变化。

3 讨 论

3.1 岩原鲤在进化中的地位

研究发现，鲤科鱼类中2n=100左右的鱼有38种或亚种，包括鲤亚科20种或亚种，鲃亚科15种或亚种，鱼句亚科1种，裂腹鱼亚科2种[8]。鲃亚科和鲤亚科具有很近的亲缘关系，关于二者的亲缘关系问题，历来是鱼类学家极感兴趣和广泛争议的问题。Nichols[11]、Zhu[12]和Smith[13]曾将鲤亚科和鲃亚科合并为一个亚科；Rendahl[14]、Lin[15]、Fang[16]、张春霖[17]、伍献文[18]和王幼槐[19]则主张将其分开。一般认为，岩原鲤属鲤亚科原鲤属，刁晓明等[20]对岩原鲤脑颅的研究发现，在系统发育中岩原鲤与鲤的亲缘关系较近,而与同属的乌原鲤关系较远；刘思阳等[21]采用RAPD标记技术对岩原鲤与鲤亚科、鲃亚科的若干种类进行遗传比较分析，发现岩原鲤的遗传特性更偏向于鲃亚科而不是鲤亚科。

表3 鲤亚科和鲃亚科染色体核型的比较

从目前的化石记录看，鲃亚科和鲤亚科均是较古老的鱼，鲤亚科鱼类出现于中新世，鲃亚科鱼类出现于始新世，后者较前者更早[8]。有关这2个亚科划分的主要特征和其中某些种类的归属一直存在争议，作为有一定性状交叉的亲缘关系较近的物种之间的分类，要重新讨论岩原鲤的归属，尚需更多细致的工作和证据。

3.2 岩原鲤的核型

鲤科鱼类基本的染色体二倍数是50或者48，这已为鱼类核型研究学者所公认[21-22]。Arai[23]在总结分析欧亚大陆已进行过核型分析的141种鲤科鱼类的基础上，认为2n=50是鲤科鱼类最原始的核型，并由2n=50朝几个方向演化，即：(1)通过非整倍性增加或着丝粒断裂，由2n=50变为2n=52；(2)通过着丝粒断裂，由2n=50或48变为2n=78；(3)通过多倍化增加，由2n=50变为2n=100或98；(4)通过罗伯逊易位，由2n=50变为2n=48，由2n=48变为2n=44；(5)通过缺失或减少，由2n=48变为2n=46。岩原鲤和其他2n=100左右的鲤科鱼类一样，都应该是四倍体物种，虽然这些鱼类的染色体数和臂数以及核中的DNA含量和某些同工酶的表达量是一般二倍体鱼类的2倍，但又有一定的差异。因此认为，现存的多倍体鱼类可能是多倍化后再经历了二倍化过程演变而来的，是二倍化了的多倍体[24]。

3.3 岩原鲤核型特征与选育

著名鱼类学家Николъский[25]认为，具有四倍体核型的物种，可表现出较强的适应性和较大的变异能力。我国学者李树深等[26]赞成这一观点，认为云南湖泊中鲤类分化强烈就是因为其具有四倍体核型，通过基因重组或突变以及生殖隔离机制而产生变异。因此，对岩原鲤和其他鲤科鱼类之间进行杂交，将有可能获得可育的具有杂交优势的后代。

[参考文献]

[1] 丁瑞华.四川鱼类志 [M].成都：四川科学技术出版社，1994:411-413.

Ding R H.The fishes of Sichuan [M].Chengdu:Sichuan Science and Technology Press,1994:411-413.(in Chinese)

[2] 蔡焰值，蔡烨强，何长仁，等.岩原鲤的生物学初步研究 [J].水利渔业，2003,23(4)：17-19,21.

Cai Y Z,Cai Y Q,He C R,et al.Preliminary study on the biology ofProcyprisrabaudi(Tchang) [J].Reservoir Fisheries,2003,23(4)：17-19,21.(in Chinese)

[3] 余先觉，周 敦，李愈成，等.中国淡水鱼类染色体 [M].北京：科学出版社，1989:1-9，78.

Yu X J,Zhou D,Li Y C,et al.Chromosome of freshwater fish in China [M].Beijing:Science Press，1989:1-9，78.(in Chinese)

[4] 吴政安.写在染色体上的生活史 [J].动物学杂志，1985(4)：49-54.

Wu Z A.Written in the chromosome of the life history [J].Journal of Animal Science,1985(4)：49-54.(in Chinese)

[5] 方耀林，周瑞琼，邹世平.GB/T 18654.12-2008 养殖鱼类种质检验:Ⅻ.染色体组型分析 [S].北京：中国标准出版社,2008.

Fang Y L,Zhou R Q, Zou S P.GB/T 18654.12-2008 Inspection of germplasm foe cultured fishes:Ⅻ.Method for the karyotype analysis [S].Beijing:China Standard Press,2008.(in Chinese)

[6] Levan A,Fredga K,Sandberg A A.Nomenclature for centrometric position on chromosomes [J].Hereditas,1964,52(2):201-220.

[7] 昝瑞光,宋 峥.鲤、鲫、鲢、鳙染色体组型的分析比较 [J].遗传学报,1980,7(1):72-78.

Zan R G,Song Z. Analysis and comparison between the karyotypes ofCyprinuscarpio andCarassiusauratusas well as Arlstichthys nobilis andHypophthalmichthysmolitrlx[J].Genetica Sinica,1980,7(1):72-78.(in Chinese)

[8] 桂建芳，李渝成，李 康，等.中国鲤科鱼类染色体组型的研究:Ⅵ.鲃亚科3种四倍体鱼和鲤亚科1种四倍体鱼的核型 [J].遗传学报,1985,12(4):302-308.

Gui J F,Li Y C,Li K,et al.Studies on the karyotypes of Chinese Cyprinid fishes:Ⅵ.Karyotypes of three Tetraploid species in Barbinae and Tetraploid species in Cyprininae [J].Genetica Sinica,1985,12(4):302-308.(in Chinese)

[9] 昝瑞光,宋 峥,刘万国.七种鲃亚科鱼类的染色体组型研究:兼论鱼类多倍体的判定问题 [J].动物学研究，1984,5(增刊1)：82-90.

Zan R G,Song Z,Liu W G.Studies of karyotypes of seven species of fishes in Barbinae:With a discussion on identification of fish polyploidy [J].Zoological Research,1984,5(Suppl.1)：82-90.(in Chinese)

[10] 蒋 进，李明云，吴尔苗.光唇鱼染色体核型分析 [J].淡水渔业，2009,39(3)：77-79.

Jiang J,Li M Y,Wu E M.Karyotype analysis ofAcrossocheilusfasciatus[J].Freshwater Fisheries,2009,39(3)：77-79.(in Chinese)

[11] Nichols J T.New Chinese fishes [J].Proc Biol Sci,1918,31:15-20.

[12] Zhu Y D.Comparative study on the scales and on the pharyngeals and their teeth in Chinese Cyprinid:With particular reference to taxonomy and evolution [M].New York:St.John’s University,1935:9-15.

[13] Smith H M.The fresh water fishes of Siam or Thailand,Smit-hsonian Inst [J].US Nat Mus Bull,1945,188:194-195,208-209.

[14] Rendahl H.Beiträgezur kenntnis der Chinesischen Süswasser-fische:Ⅰ.Systematischer teil [J].Arkivför Zoologi,1928,20:1-149.

[15] Lin S Y.Contribution to a study Cyprinidae of Kwangtung and Adjacent Provinces [J].Lingnan Sci Journ,1933,12(3):346-348.

[16] Fang P W.Chinese fresh-water fishes referring to Cypininae [J].Sinensia,1936,7(6):686-712.

[17] 张春霖.中国系统鲤类志 [M].北京：高等教育出版社，1959.

Zhang C L.Cyprinidae of China [M].Beijing：Higher Education Press,1959.(in Chinese)

[18] 伍献文.中国鲤科鱼类志:下卷 [M].上海：上海人民出版社,1964:395-438.

Wu X W.The Chinese carps Chronicles(2) [M].Shanghai：Shanghai People’s Publishing House,1964:395-438.(in Chinese)

[19] 王幼槐.中国鲤科鱼类的分类、分布、起源及演化 [J].水生生物学集刊，1979,6(4)：419-438.

Wang Y H.On the classification,distribution,origin and evolution of the fishes referred to ethe subfamily Cyprininae of China,with description of new species [J].Acta Hydrobiologica Sinica,1979,6(4)：419-438.(in Chinese)

[20] 刁晓明，李 华，苏胜齐，等.岩原鲤脑颅的研究 [J].西南农业大学学报，1964,16(5)：500-502.

Diao X M,Li H,Su S Q,et al.Study on neyrocranium ofProcyprisrabaudi(Tchang) [J].Journal of Southwest Agricultural University，1964,16(5)：500-502.(in Chinese)

[21] 刘思阳，孙玉华，杨 帆，等. 以RDPD方法分析岩原鲤分类地位 [J].武汉大学学报:理学版，2004,50(4)：477-481.

Liu S Y,Sun Y H,Yang F,et al.Indentification analysis ofProcyprisrabaudiby RAPD [J].Journal of Wuhan University:Natural Science Edition,2004,50(4)：477-481.(in Chinese)

[22] 周 敦.鱼类染色体研究 [J].动物学研究,1984,5(3):38-51.

Zhou D.Study of fish chromosome [J].Zoological Research,1984,5(3):38-51.(in Chinese)

[23] Arai R.A chromosome study on two cyprinid fishes,AcrossocheiluslabiatusandPseudorasborapumilapumila,with notes on Eurasian Cyprinids and their karyotypes [J].Bull Nat Sci Mus Ser A,1982,8(3):131-152.

[24] Dover G A,Flavell R B.Genome Evolution [M].NewYork：Academic Press，1982：219-236.

[25] Николъский Г В. О некоторьlх законоmeрностях в распрепеии чнсеа хромосом у рыб [J].Воnp Ихтuoл，1973,13(1)：3-22.

[26] 李树深,王蕊芳,刘光佐,等.云南湖泊鱼类的区系及其类型分化 [J].动物学报，1982,28(2)：169-176.

Li S S,Wang R F,Liu G Z,et al. Fish fauna and its differentiation in the upland lakes of Yunnan [J].Acta Zoologica Sinica，1982,28(2)：169-176.(in Chinese)