UPLC法同时测定人参糖中7种人参皂苷

逄世峰，曲正义，李亚丽，孙成贺，王英平

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

人参为五加科人参(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根， 自古以来被誉为“草药之王”。人参皂苷是人参属植物中重要的活性成分[1，2]，具有抗肿瘤[3]、抗疲劳[4]、降血糖[5]、抗炎[6]以及改善学习记忆能力[7]等多种生物活性。2012年，卫生部批准人参作为新资源食品，人参糖作为人参食品的典型代表，已逐步被消费者所认可[8]。作为标志性成分，人参皂苷是人参食品中必测指标[9]。目前，尚未见人参糖中人参皂苷类成分检测方法的研究。本试验建立了一种UPLC法测定人参糖中7种人参皂苷的方法，为人参糖中人参皂苷含量测定和质量安全提供参考依据。

1 仪器、试剂和材料

1.1仪器

超高效液相色谱仪ACQUITY(美国Waters公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试剂

乙腈为色谱纯(美国fisher公司)，水为超纯水(美国Millipore公司)，其他试剂均为分析纯(天津津腾实验设备有限公司)。

1.3材料

人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd(中国药品生物制品检定所)；人参硬糖、人参软糖(康美新开河参业有限公司)。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液制备

精密称取7种人参皂苷标准品，配制成含有人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd分别为0.97mg/mL、1.03mg/mL、0.54mg/mL、1.04mg/mL、0.57mg/mL、0.55mg/mL、0.93mg/mL的混合对照品溶液。

2.2色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，流动相乙腈-水(梯度洗脱：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～5min，21%～26%乙腈；5min～9min，26%～27%乙腈；9min～12min，27%～32%乙腈；12min～15min，32%～43%乙腈)，流速0.5mL/min，检测波长203nm，柱温35℃，进样量2μL。

2.3线性关系

精密吸取混合对照品溶液0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL，分别定容至10mL容量瓶中，制成一系列浓度的混合标准品溶液，在上述色谱条件下，注入超高效液相色谱仪。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程分别为：Rg1：Y=497 000X-2380(r=0.9995)、Re：Y=651 000X-5240(r=0.9995)、Rf：Y=460 000X-1370(r=0.9995)、Rb1：Y=482 000X-4150(r=0.9995)、Rc：Y=546 000X-2540(r=0.9993)、Rb2：Y=573 000X-2170(r=0.9994)、Rd：Y=433 000X-2780(r=0.9995)。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd线性范围分别为0.0097mg/mL～0.097mg/mL，0.0103mg/mL～0.103mg/mL，0.0054mg/mL～0.054mg/mL，

0.0104mg/mL～0.104mg/mL，0.0057mg/mL～0.057mg/mL，

0.0055mg/mL～0.055mg/mL，0.0093mg/mL～0.093mg/mL。

2.4供试品溶液的制备

人参硬糖供试品溶液制备：将人参硬糖粉碎，取样品5g，置三角瓶中，加入蒸馏水60mL，使样品完全溶解，再加入140mL甲醇，于85℃回流提取6h。将提取液全部转移至蒸发皿中，水浴蒸干。用蒸馏水溶解提取物，加蒸馏水100mL置分液漏斗中，用乙醚100mL萃取3次，后用水饱和正丁醇100mL萃取3次，再用正丁醇饱和水萃取3次，取上层液蒸干，加甲醇溶解后，转移至5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

人参软糖供试品溶液制备：将人参软糖剪碎、研磨，取样品5g，置三角瓶中，加入蒸馏水60mL使样品完全溶解，再加入140mL甲醇，于85℃回流提取6h。将提取液全部转移至蒸发皿中，水浴蒸干。用蒸馏水溶解提取物，加蒸馏水100mL置分液漏斗中，用乙醚100mL萃取3次，后用水饱和正丁醇100mL萃取3次，再用正丁醇饱和水萃取3次，取上层液蒸干，加甲醇溶解后，转移至5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。标准品和样品UPLC色谱图见图1。

2.5精密度试验

取混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色谱峰面积的RSD(n=6)分别为0.19%、0.21%、0.53%、0.35%、0.67%、0.27%、0.15%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0h、12h、24h、36h、48h进样测定，人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色谱峰面积的RSD分别为1.03%、0.47%、1.84%、2.37%、0.96%、0.85%、0.79%。结果表明，样品在48h内稳定。

2.7重复性试验

取同一份样品，制备6份供试品溶液，得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd平均含量的RSD分别为2.76%、2.87%、2.54%、2.93%、2.15%、2.07%、2.46%。结果表明，方法重现性良好。

2.8加样回收率试验

取已知含量的样品，添加一定量的人参皂苷对照品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定(表1)。

表1加样回收率

Table 1Sample recovery rate (n=6)

2.9样品含水量测定

按照“GB/T 5009.3”规定方法[10]测定样品中水分(表2)。

表2人参糖含水量测定结果

Table 2content of water in ginseng sweets (n=3)

2.10样品含量测定

按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，以干物质计(表3)。

3 讨论

3.1提取溶剂的选择

人参糖中可能添加人参粉、人参提取物等不同人参原料，水提取人参粉中皂苷效果并不理想。因此，应选择有机溶剂提取。但人参糖中含有大量的糖类，直接用有机溶剂提取，糖类凝结，无法保证提取效果。因此，本研究先用60mL水将人参糖溶解，再加入140mL甲醇提取的方法，可消除上述影响。

表3人参糖中7种人参皂苷含量

Table 3content of seven Ginsenosides in ginseng sweets (mg/g)

3.2样品取样量的选择

称取样品过多时，样品不易溶解，成黏稠状，不易萃取；称取样品过少时，人参皂苷含量较低，影响测定结果。经多次摸索，最终确定取样量为5g。

3.3人参总皂苷纯化方法的选择

本实验采用溶剂萃取法对人参皂苷进行纯化。先用乙醚萃取，对粗提液进行脱脂，再用水饱和正丁醇萃取样品中人参皂苷，最后用正丁醇饱和水去除样品中过量的糖类。文献报道[11，12]采用D-101大孔吸附树脂进行纯化，虽效果较好，但需对大孔树脂进行预处理、装柱、洗柱等步骤，方法繁琐、耗时；而溶剂萃取法简便、用时少，通过上述萃取方法可消除大部分杂质。所以，本实验采用溶剂萃取法对人参糖中的人参皂苷进行分离纯化。

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