痘病毒入侵融合复合物的研究进展

卢 昌，吴国华，王 曼，颜新敏，赵志荀，吴 娜，朱海霞，李 健，张 强

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃省生物检测工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046）

痘病毒是一种比较大的、复杂的、有包膜的DNA病毒，该病毒可以在脊椎动物或非脊椎动物细胞的细胞质内完成复制。痘病毒大约有100个或更多的同源性较高的基因存在于所有脊椎动物痘病毒中，50个同源基因存在于脊椎动物痘病毒和昆虫痘病毒中。这些高度保守基因的产物参与了病毒的入侵、基因表达、DNA复制、分子内二硫键的形成以及病毒粒子组装。然而，那些保守性不高基因的产物则参与了病毒与宿主的特异性反应[1]。目前研究最为透彻的属于正痘病毒基因组，包括天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒。由于天花病毒、猴痘病毒可能被作为潜在的生物武器使用，人们对正痘病毒的研究也越来越多。痘苗病毒是痘病毒科最典型的成员，其曾经作为天花病毒的疫苗使用。虽然天花病毒的疫苗可以为人们提供不错的保护，但是接种以后仍然会引起皮肤脓疮以及淋巴结疾病和发热，严重的甚至可以威胁生命安全，因此也需要一种安全而有效的天花疫苗。痘苗病毒的研究不仅为有效的天花疫苗研究提供了基础，还为痘病毒科其他成员的研究提供了模板[2]。

绝大多数DNA病毒可以利用宿主细胞的蛋白来完成自身基因组的复制和蛋白的表达。然而，痘苗病毒（Vaccinia virus，VACV）完全可以利用病毒自身编码的蛋白在宿主细胞的细胞质种完成它的生命活动。当感染性病毒粒子入侵到宿主细胞质以后，病毒利用包膜上的蛋白质和酶完成病毒早期mRNA和蛋白质的合成，紧接着VACV利用这些蛋白质完成病毒DNA的复制。随后VACV以复制的DNA为模板完成中后期mRNA的合成，其合成的蛋白质参与痘病毒的生命周期，如VACV的抗病毒作用以及痘苗病毒入侵宿主细胞。VACV与痘苗病毒属其他成员一样有许多不同感染形式，如成熟的病毒粒子（MV）、有包膜的病毒粒子（WV）以及细胞外的病毒粒子（EV）。VACV的MV包括一个含有双链DNA的病毒核心，两个蛋白侧体以及一层囊膜，囊膜上含有20多种病毒蛋白。一些MV可以被修饰后的高尔基体膜或者包内囊泡包裹，从而形成MV，同时另外一些MV随着细胞的裂解释放到细胞外。EV外膜上含有6种不同的病毒蛋白。MV的产量比较高，可以介导病毒在不同宿主间的传播，而EV介导病毒在同一宿主体内的传播[3]。

许多有包膜的病毒只需要编码一种或两种蛋白质就可以满足病毒的吸附和入侵，然而痘苗病毒需要11种～12种蛋白质完成这个过程。这些蛋白最初是通过鉴定跨膜蛋白的时候被发现，并且它们在所有痘病毒种十分的保守，并且构建突变株来确定它们的表型。目前9种蛋白（A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5和 O3）可以构成完整的入侵融合复合体（entry／fusion complex，EFC），并且将 F9和L1定义为EFC相关蛋白[4]。EFC随着痘苗病毒DNA复制的完成而合成，并且专门用于进行病毒入侵。

1 入侵融合复合体亚基蛋白的结构

VACV的MV囊膜上含有20多种结构蛋白，这些蛋白主要参与病毒囊膜与内吞小泡膜之间的融合，使得病毒核心能够进入细胞质。VACV的融合是由EFC介导的，而EFC由MV或MV样例子的囊膜蛋白组成的，其中包括 A16[5]、A21[6]、A28[7]、G3[8]、G9[9]、H2[10]、J5[11]、L5[12]、O3[13]及 F9[14]和L1[15]。其中 A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5或O3其中任何一种蛋白不能表达时，则不会形成稳定的EFC，它们组成EFC的核心。而L1和F9并不是EFC组装所必须的，L1和F9结合在EFC周围，被称为EFC相关蛋白。经多序列比对发现，VACV的这11种蛋白同系物之间有着一些保守的特征，比如保守的扩膜结构域，保守的Cys残疾以及分子内二硫键。对这11种蛋白的同源物进行BLAST搜索，我们可以找到包括羊痘病毒属在内的多种痘病毒与之同源的蛋白，并且在其他病毒中没有找到与之同源的蛋白。编码EFC蛋白基因的转录本都是在病毒感染晚期检测到的，且试验证明EFC蛋白是VACV晚期基因编码的重要结构蛋白。对这些基因的序列分析发现，其ORF上有启动子附近存在着保守的TAAATGG序列，该序列是VACV晚期启动子所特有的[16]。

EFC结构蛋白的大小约在4ku～43ku之间，与其他病毒的Ⅰ型和Ⅱ入侵融合蛋白不同，VACV的EFC蛋白都是非糖基化的蛋白。EFC蛋白最初是通过鉴定跨膜蛋白的时候发现的，其中A21、G3、H2和O3拥有N端跨膜结构域，而A16、F9、G9、J5、L1和L5拥有C端跨膜结构域。研究发现，这些蛋白通过其跨膜结构域与MV相连接，非跨膜结构域暴露于MV的囊膜外，发挥一定的生物学功能。疏水结构分析发现，G3L有2个疏水结构域，分别位于N端和C端。而G3L通过其N端疏水结构域结合到MV囊膜上，其C端结构域可能结合到EV的囊膜表面。同时，G3L中间区域的保守型远低于其N端和C端的疏水结构域，具体原因还不清楚[8]。值得注意的是含有35个氨基酸残基的O3是VACV编码的最小的蛋白。O3其他痘病毒的同源蛋白大小在29个～48个氨基酸残基之间，并且它们之间氨基酸的一致性比较低，但是可以弥补O3的删除突变。痘病毒科O3L的TM结构域十分的重要，其N端螺旋结构长度一样，且后面都含有一个基础的氨基酸和Pro残基，再者其C端没有保守的结构，长度变化很大，这说明EFC结构成员之间的相互作用可能是由TM决定的[13]。

VACV基因组可以编码3种氧化还原酶（E10、A2.5和G4），这3种酶可以催化IMV的膜蛋白形成分子内二硫键。除了O3L和G3L以外，VACV的其他入侵融合蛋白都是通过VACV特有的氧化还原途径形成保守的分子内二硫键。迄今为止，尚未发现VACV其他蛋白通过该途径形成分子内二硫键。Senkevich T G等[17]研究发现，EFC蛋白的分子内二硫键并不参与EFC的形成，可能在稳定EFC结构和EFC发挥生理功能时起着一定的作用。其他病毒的EFC分子内二硫键在病毒与宿主细胞膜融合过程中有着重要作用，因而我们假设VACV的EFC分子内二硫键也可能起着同样的作用。

EFC相关蛋白L1是目前为止研究的比较清楚的蛋白质。L1蛋白是VACV一个强有力的中和性抗体，且其暴露于MV的表面。研究发现，L1R至少存在2个抗原位点，其中一个中和表位位于118～128，且抗L1R的中和抗体可以促进VIG的效应。L1蛋白的N－端结构十分的保守，存在烷基化保守的结构 G－X－X－X－S／T。该蛋白可以在其 N 端的倒数第2个甘氨酸残基上发生烷基化，并且烷基化需要其N端12个氨基酸残基的参与。N端甘氨酸的突变可以抑制感染性VACV的互补作用，共聚焦显微镜数据显示该突变可以改变L1在细胞内的定位，并且可以减少分子内二硫键的形成。但是N端甘氨酸的突变并没有影响其与EFC和MV的结合。L1的晶体结构是α－螺旋束包裹两条的β－折叠。L1蛋白的胞外结构含有一个内部疏水凹陷，该凹陷可以容纳一个十四烷酸分子，且该凹陷接近于L1蛋白的N端。L1蛋白的烷基化位点是通过蛋白酶水解暴露出来的，且L1蛋白的二硫键可以稳定该结构。此外，可溶性L1可以在病毒吸附阶段抑制VACV的入侵，并且L1可以结合到细胞表面，与细胞表面的黏多糖发生相互作用，这些证据都表明L1蛋白可能是病毒受体蛋白[18]。

2 入侵融合复合体亚基蛋白的作用

VACV的EFC蛋白最早是从感染细胞膜上分离得到的，随后通过免疫共沉淀等技术对VACV其他的EFC蛋白进行了初步的分离和鉴定。通过对EFC缺失毒株的研究发现，EFC蛋白在VACV新陈代谢过程中有着比较相似的作用。在噬斑试验中，EFC亚基缺失毒株形成的噬斑明显小于野生型毒株形成的噬斑，同时EFC亚基缺失毒株的病毒滴度明显低于野生型。这些数据都表明EFC亚基是VACV完成复制所必须的，与病毒的独立密切相关。在电子显微镜下对EFC亚基缺失的VACV病毒粒子和野生型VACV病毒粒子的形态进行观察，发现2个病毒粒子的形态几乎完全相同，无法在电子显微镜下进行区别。这表明，EFC亚基并不参与病毒粒子的组装，EFC亚基的缺失不会影响病毒粒子的形态。

有研究表明，VACV的MV是通过胞吞的方式内化进入宿主细胞的。病毒以胞吞方式侵入宿主细胞主要包括两个步骤结合和内化。VACV入侵宿主细胞的最后一步是病毒囊膜与内吞小泡膜发生融合，结果使病毒核心进入细胞质。用MV膜上L1蛋白抗体检测病毒粒子与细胞膜的结合，用A4核心蛋白抗体检测细胞之内病毒粒子的核心[19]，结果显示EFC亚基缺失不会影响MV结合到细胞膜上，但是会影响病毒粒子的脱壳，阻碍病毒粒子进入细胞质内。野生型VACV感染的细胞如果暴露于低pH环境就可以形成合胞体，这种过程被称为从内部融合，这个过程主要依赖于感染细胞表面的MV。研究发现，EFC也参与VACV内部融合的合胞体的形成过程，EFC亚基的缺失将阻碍VACV感染细胞合胞体的形成[20]。

MV囊膜上的A25／A26蛋白异二聚体可以抑制EFC的功能，因此可以防止EFC介导的融合提前发生，当缺少其中任何一种蛋白时膜融合就能在中性pH条件下发生。因此可以简单的推测，内吞小泡内的酸性环境使A25／A26异二聚体解离，从而解除对EFC功能的抑制，导致膜融合发生。但是用酸或蛋白酶对MV进行预处理可以加速病毒的入侵，这表明酸性环境导致的A25／A26异二聚体解离是部分可逆的，或者不足以启动融合。一些VACV毒株不需要酸性条件即可发生融合，这可能因为他们不表达A25／A26蛋白异二聚体[21]。

此外，许多病毒编码的蛋白质都可以被十四烷酸所修饰，且这些蛋白一般位于病毒的衣壳或囊膜上。烷基化的蛋白在病毒代谢过程中有着重要的作用，例如小核糖核酸病毒的烷基化蛋白VP4是感染性病毒粒子组装所必须的，也影响着病毒感染细胞过程中病毒脱衣壳。同样在痘苗病毒的EFC中也存在着3种可以烷基化的蛋白质，G9R、A16L和L1R，这些蛋白的N端存在着可以发生烷基化的位点。这些蛋白的烷基化可以调节其余病毒囊膜或病毒其他成分之间的反应，从而影响病毒粒子的组装、成熟与释放。除了L1R蛋白的烷基化研究的比较透彻以外，其他两类蛋白是如何烷基化的，以及烷基化后对病毒的影响还不是十分的清楚。

3 入侵融合复合体亚基之间的相互关系

当EFC蛋白中的任何一种蛋白合成被抑制时，EFC将变的十分的不稳定[10]，这说明EFC是通过亚基之间的相互作用结合到一起的。然而即使在一些不稳定条件下，一些EFC亚基之间的作用依然存在，如G3和L5之间的相互作用[8]。EFC亚基之间的相互作用包括 H2与 A28[10]、A16与 G9[9]、G3与L5[8]等。H2蛋白的性质与A28比较相似，Nelason等研究发现H2与A28之间可以发生直接的相互作用。A28是VACV重要的中和抗体，其免疫原性可以增强与H2之间的相互作用。Shinoda K等[22]研究发现，A28与H2共表达可以增强A28的中和活性，并且VACV的中和表位存在于A28蛋白的C－端区域。G3L可能也与A28L、H2R、A21L发生结合作用，但是在EFC形成过程中G3L是如何与这些蛋白相互作用的还不清楚。A16∶G9也可以与融合调节蛋白异质二聚体A56∶K2相互作用，也可以与A26蛋白相互作用，这种结合可以抑制感染细胞多合胞体的形成。

在EFC亚基中，J5、A16和G9之间的同源性比较高，它们在痘病毒科中都十分的保守，且它们有可能起源于同一个基因，经过不同的进化而在痘病毒入侵过程中行使不同的功能。值得注意的是，这3种蛋白中Cys残基的位置十分保守，即A16中分子内二硫键形成的位置与G9和J5中分子内二硫键形成的位置完全一样。

4 小结

VACV的MV上将近有20多种跨膜蛋白，其中有9种蛋白属于VACV的EFC蛋白，2种蛋白属于EFC相关蛋白。这11种蛋白在结构上几乎没有相关性，且每一种蛋白都是痘苗病毒入侵／融合所必须的，因此它们在功能和结构上并不存在冗余。然而，这些蛋白却有着一些共同的性质：①在所有痘病毒属中都十分保守，是一个普遍的入侵机制；②在病毒感染晚期的病毒粒子组装时表达；③拥有一个跨膜区域；④属于MV囊膜上的非糖基化蛋白；⑤可以通过痘病毒细胞质的氧化途径形成一个或多个分子内二硫键；⑥不影响病毒粒子的形态。目前我们还不能很好地解释为什么痘病毒入侵需要如此多的蛋白质参与。

此外，小分子质量蛋白I2的条件致死性突变表型与其他EFC蛋白的条件致死性表型一样，因此该蛋白可能属于EFC蛋白。由于I2蛋白的分子质量较小及其疏水性的缘故，不能使用质谱法对该复合物进行纯化，无法对该蛋白的性质进行进一步的研究[23]。

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