牛呼吸道合胞体病毒检测方法研究进展

杨洺扬，王 炜，李真光，董 鹏，胡桂学，武 华，陈立志，程世鹏，冷 雪＊

（1.中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林130122；2.吉林农业大学，吉林长春130118；3.华威特（北京）生物科技有限公司，北京100085）

牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为单股负链RNA病毒［1］。病毒基因组从3′端到5′端转录，得到10个mRNA，这10个mRNA翻译11个蛋白，分别为 NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2－1、M2－2和 L［2－3］。20世纪70年代初牛呼吸道合胞体病被公认为犊牛呼吸道系统主要疾病，BRSV呈世界性分布，广泛分布于美国、加拿大、瑞士、比利时、澳大利亚、日本等国家。犊牛较为易感，潜伏期可长达几个月，因此牛群间的潜伏期感染很难得到控制。其高发病率、高病死率对养牛业及奶制品市场造成了严重影响［4］。目前，我国市场上尚无用于该病防控的疫苗应用，因此，建立快速的检测方法，淘汰阳性牛，对于降低该病造成的损失就显得尤为重要。国内外对BRSV的检测均进行了大量研究，首先结合流行病学和临床检查做出初步诊断，然后根据实验室方法进行确诊，实验室方法主要包括病原学和血清学方法，现对其进行综述如下。

1 流行病学

1970年首次从患病牛体内分离到BRSV，随后在欧洲和北美等国家相继报道出现BRSV。牛呼吸道合胞体病广泛分布于世界各国，是具有很强传染性的急性、热性牛呼吸道疾病，山羊、猪和马也可能感染［5］。牛呼吸道合胞体病常发生于秋冬季温带地区，往往由动物转群引起，既能够通过动物之间直接接触传播，也可以通过带毒动物呼吸道分泌物或气雾传播，其发病率很高占乳牛呼吸道疾病的60%。一般来说其发病情况与种群密度、年龄结构密切相关［6－7］。目前有研究认为，其最具威胁的传染源来自亚临床感染动物本身［8］，它们携带的病毒可能引起疫情在牛群中暴发，但仍需进一步证明。

2 临床症状

病牛表现为精神沉郁、体温升高、干咳、呼吸道有浆液性鼻液或伴有湿性咳嗽［9］。潜伏期大约3d～5d，急性型突然发热、呼吸困难、呼吸频率加快、张口呼吸［10］。肺部听诊支气管音增强有湿啰音、捻发音。肺泡呈间质性肺炎变化，可能伴有肺水肿和肺气肿，背部区肺泡壁破裂。少数患病牛有皮下肺气肿，肺腹侧粘连，背侧部肿胀。胸膜、肺小叶有气肿性损伤。剖检可见肺脏坚实，肺泡膈叶肿大，有纤维蛋白渗出。乳牛在感染BRSV后表现为泌乳量减少或停乳，妊娠母牛感染BRSV后会引起流产。

3 病原学检测

3.1 细胞分离培养

细胞分离培养鉴定是最直观的病毒鉴定方法。培养BRSV可以用Vero细胞、MDBK细胞或牛鼻甲骨细胞［11］。将待检病料接种细胞后传代培养，第一代一般不出现细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），随着传代次数增加，出现CPE时间缩短，病变初期出现细胞融合，晚期聚集、圆缩，形成合胞体［12］，细胞液可见轮廓明显嗜酸性包涵体［13］。

3.2 聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）通过扩增病毒基因片段来检测病毒，是近年来快速发展和应用的病原学检测方法，PCR以它特异性强、敏感性高、高效快速的特点已经成为实验室诊断最常用的方法。Vilcek M等［14］建立了BRSV套式PCR检测方法，这种方法大大提高了检测的敏感性，在对35个临床样品的检测中阳性检出率达到89%，远高于采用传统免疫荧光方法检测的66%。Boxus M 等［15］建立了RT－PCR方法检测BRSV，引物及探针设计来自于BRSV核蛋白保守区序列，具有很好的重复性和特异性，敏感性能够达到传统PCR方法的100倍。在国内，王红等［16］在2008年也建立了BRSV的RT－PCR检测方法。Thonur L等［17］开发了一步多重实时定量RT－PCR检测方法，该方法可以快速的同时检测牛呼吸道合胞体病毒、牛疱疹病毒1型和牛副流感病毒3型3种主要牛呼吸道病毒。阳性检出率高达97%，敏感性与单一PCR基本一致。我国科研工作者也于2013年建立了牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型的多重PCR检测方法［18］。这种方法凭借它快速、高特异性、敏感性以及节约成本等特点，将在牛呼吸道病毒检测中得到广泛应用。Masayuki U等［19］在2013年开发的微滴RT－PCR可在10min内完成PCR检测，大大提高了诊断效率。

4 血清学诊断

4.1 中和试验

以待检血清和标准毒进行中和试验，将待检血清用稀释液进行2倍递增稀释之后加入等量标准病毒液（200TCID50／0.1mL）充分混合。37℃感作1h后将混合液接种在铺满单层Vero细胞的96孔培养板，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养，48h后开始观察，14d判定最终结果。中和抗体效价2倍以上为阳性血清［20］。中和试验是传统的病毒诊断方法，但诊断时间较长，对人工免疫后动物无法诊断。

4.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）作为一项血清学诊断技术，已在动物疫病诊断工作中已经得到了广泛应用。由于酶的高效催化作用使其对抗原抗体结合识别起到了放大作用，从而达到了快速、灵敏、高效的检测要求，是重要的疫病早期诊断方法。Rhodes M B等［21］开发了阻断ELISA检测BRSV的方法，采用辣根过氧化氢酶标记抗体，抗原抗体特异结合后洗涤，滴加底物溶液，通过测定底物吸光值确定抗原抗体含量。相比于传统中和滴定试验，这种方法能够更早期的检测到血清中的抗体，而且其特异性明显优于其他ELISA方法。在我国，王红等建立了以BRSV重组N蛋白为包被抗原的的间接ELISA检测方法，并且进一步证明这种方法的符合率、敏感性、特异性分别达到了87.7%、90.9%和85.0%，为今后开发ELISA试剂盒提供了有效的技术手段。近些年，国内外还报道了斑点ELISA［22］、夹心ELISA［23］、多重 ELISA［24］及 Luminex多元血清检测［25］等方法，都显示出相比于传统检测方法更高的敏感性和更快的速度。

4.3 直接免疫荧光抗体试验

将待检牛鼻拭子处理后固定在载玻片上，用可以与BRSV F蛋白特异结合的荧光标记物质结合，培养后洗去未结合的荧光物质，在荧光显微镜下观察是否有荧光物质［26］。这种方法敏感性高，速度快，但非特异性染色仍有待解决，结果判定客观性不足，试验操作比较复杂。

随着国内外科研工作者对牛合胞体病毒的潜心研究，特异性强、敏感性高、操作简便快捷的检测方法将逐渐取代传统的检测手段，不断优化的商品化BRSV检测试剂盒的问世也将为牛呼吸道合胞体病的诊断和预防提供有力的保障。

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