健脾补肾法对慢性乙型肝炎患者Th9/Treg 平衡的影响及意义*

刘肄辉 张永华 刘 莉 周红娟 冯 慧

浙江省中西医结合医院肝病科(浙江 杭州，310003)

Th9 (辅助性T 淋巴细胞9)是新发现的CD4+T细胞亚群，在一些疾病中被证实具有免疫调节作用，有促炎效应［1，2］，其在分化与功能上与Treg (调节性T 细胞)具有一定的相关性，而Treg 在慢性乙型肝炎(CHB)中主要起免疫抑制作用，有抗炎效应。CHB 患者中是否存在Th9/Treg 失衡尚未见报道。我们应用健脾补肾中药联合核苷 (酸)类似物治疗CHB 患者，发现其能通过调节Th9/Treg 提高CHB 的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 选择浙江省中西医结合医院肝病科符合抗病毒治疗的CHB 患者100 例，分为观察组与对照组，每组各50 例;同时选择健康志愿者50 例，由浙江省中西医结合医院伦理委员会讨论通过并签署知情同意书。诊断标准符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》［3］，年龄、性别、病程等一般资料差异无统计学意义(P ＞0.05)。所有患者6 个月内未接受抗病毒治疗或免疫调节治疗。排除合并HAV、HCV、HEV 等病毒感染、排除合并脂肪性、酒精性和遗传代谢性肝病、失代偿性慢性肝病以及自身免疫相关的其他疾病、无心脑血管、肝、肾和造血系统重大疾病及精神病患者;排除妊娠或哺乳期妇女。

1.2 治疗方法 观察组:服用核苷(酸)类似物，其中拉米夫定16 例(贺普丁，葛兰素史克公司生产)，100mg/次，1 次/d;阿德福韦酯25 例(贺维力，葛兰素史克公司生产)，10mg/次，1 次/d;恩替卡韦9 例(博路定，上海施贵宝公司生产)，0.5mg/次，1 次/d。同时加用健脾补肾中药治疗，组方为黄芪、紫河车、至灵菌丝、女贞子、三七，由浙江省中西医结合医院制剂室加工成水煎剂200ml，每天分二次口服。对照组仅服核苷(酸)类似物，其中拉米夫定19 例;阿德福韦酯27 例;恩替卡韦4 例;产地、用法用量同观察组。疗程24 周。两组观察期间停用一切保肝降酶等药物。

1.3 观察指标

1.3.1 乙肝病毒血清标志物、ALT、HBV DNA 等指标检测 每4 周测定1 次。

1.3.2 外周血Th9 细胞检测 全血标本:100μl 不含血清的RPMI 1640，1∶1 等体积稀释PBMC:200μl(2 ×106/ml)=4 ×105个细胞，加1μg/ml PMA 工作液5μl，50μg/ml Iomomycin 工作液4μl，0.1mg/ml Momensin 工作液3.4μl，37℃，5% CO2培养箱培养4～6h。混匀，加入5μl CD3 -FITC 和5μl CD8 -PE-Cy5，室温，避光孵育15 min;分成2 管，每管加入100μl 已染色的全血;每管中加入100μl Fix＆Perm中的Reagent A (即固定液)，室温，避光孵育15min;每管中加入3ml PBS，1200 rpm 离心5min，弃除上清。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent B (即破膜和溶血)，同时各管中按下表加入相应的抗体各10μl:Mouse IgG1 -PE，IL -9 -PE;室温，避光孵育15min。每管中加入3ml PBS，1200 rpm 离心5min，弃除上清;0.5ml PBS 重悬细胞，上机检测。治疗前后各检测1 次。

1.3.3 Treg 细胞检测 在每个流式上样管中加入100μl 准备好的细胞悬液，细胞数约为1 ×106个。按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原CD4、CD25。用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer 或预冷的PBS洗涤细胞。旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋涡混匀。避光4℃孵育30～60min。加入2ml Permeabilization Buffer (ebioscience，目录号00 -8333)工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

重复第6 步操作洗涤细胞。加入稀释好的2%(2μl)的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer 工作液进行稀释)100μl，避光4℃孵育15min。封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记Foxp3 抗体20μl，避光4℃孵育至少30min。加入2ml Permeabilization Buffer 工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。重复上一步洗涤细胞。用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测分析。治疗前后各检测1 次。

1.4 统计学方法 数据统计采用SPSS 13.0 版本。计量资料以(± s)表示，两组均值比较采用t 检验，计数资料采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB 组与健康对照组Th9、Treg、Th9/Treg 的比较 见表1。

表1 乙肝病毒感染者与健康对照组Th9、Treg 的比较(±s)

表1 乙肝病毒感染者与健康对照组Th9、Treg 的比较(±s)

与对照组比较* P ＜0.05

2.2 健脾补肾法对CHB 患者Th9/Treg 平衡的影响观察组Th9、Treg、Th9/Treg 治疗前后比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)，对照组Th9、Treg、Th9/Treg 治疗前后比较差异均无统计学意义(P ＞0.05);观察组与对照组Th9、Treg、Th9/Treg 治疗后比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 健脾补肾法对CHB 患者Th9/Treg 平衡的影响［n (%)］

2.3 健脾补肾法对CHB 患者疗效的影响 观察组ALT 复常率与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，观察组HBV DNA 转阴率与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，观察组HBeAg 血清学转换率与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表3。

表3 两组患者疗效比较［n (%)］

3 讨论

近年来，研究发现CD4+Th 细胞除Thl 细胞和Th2 细 胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)、Th17 外，可能还存在一个新的Th 细胞亚群-Th9［4，5］。目前研究表明，Th9 细胞在哮喘和结核病的病理过程中起着重要作用［1，2］。作为新发现的T 细胞亚群，IL-9 是其主要的效应因子，是促进炎症发生的关键因素［5］，但在CHB 中Th9 的具体表达状况尚未见报道。另一类CD4+T 细胞亚群-CD4+CD25+Foxp3+Treg 被认为具有免疫抑制和抗炎作用［6］。在缺乏IL-4 的情况下，TGF-β 可诱导初始T 细胞向Treg 转化，起到抑制炎症的作用，当加入IL-4 后初始T 细胞明显向Th9 转化，产生致炎效应，推测其在分化上具有相关性;从Th9 具有致炎作用，Treg 具有抗炎作用，推测其在功能上具有拮抗性。本研究结果显示CHB 患者Th9、Treg 频率均比健康对照高，Th9、Treg、Th9/Treg 比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明CHB 患者Th9/Treg 存在免疫失衡，为影响CHB 的重要因素。

CHB 的发病机理中至少包括宿主免疫、病毒两大因素，中医认为CHB 病因病机为“邪毒为标，正虚为本”。治疗上应牢牢把握正虚邪实这一主线，采用扶正祛邪之法。但目前CHB 的治疗西医主要以核苷(酸)类似物为主，侧重于抗病毒，作用单一，我们认为核苷(酸)类似物的抗病毒作用类似于中药的清热解毒，两者联用时，中药处方应有所改变，此时应以扶正中药为主，达到扶正固本的目的。健脾补肾方以黄芪、紫河车、至灵菌丝等为主药，功擅扶正托毒，现代研究证实上述药物具有良好的免疫调节等功效［7，8］。我们在前期相关研究中发现健脾补肾法联合拉米夫定治疗CHB 具有增效减毒的作用，其机理与中医健脾补肾中药能够调节树突状细胞功能、CD4+T/CD8+T 细胞，Th1/Th2 等机体细胞免疫因素有关［9～11］。

本研究结果显示:观察组Th9、Treg、Th9/Treg治疗前后比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)，对照组Th9、Treg、Th9/Treg 治疗前后比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)，观察组与对照组Th9、Treg、Th9/Treg 治疗后比较差异均有统计学意义 (P ＜0.05)。结果表明单一核苷(酸)类似物抗病毒治疗对Th9/Treg 失衡影响有限，而健脾补肾中药可以促进Th9/Treg 失衡的恢复，与核苷(酸)类似物有协同增效的作用。同时研究发现观察组ALT 复常率与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，观察组HBV DNA 转阴率与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，说明健脾补肾中药可以提高核苷(酸)类似物治疗CHB 的早期应答疗效，早期应答与远期疗效密切相关，早期应答好，则远期HBeAg 血清学转换率和完全应答率、持续应答率高，病毒变异率低。其机理可能与健脾补肾中药调节Th9/Treg 相关，而机体免疫失衡后恢复正常对病毒的控制作用是药物无法比拟的。本研究中两组HBeAg 血清学转换率差异无统计学意义可能与病例数少、观察时间短等有关。因此，需要扩大样本量、延长观察时间进一步探讨健脾补肾中药治疗CHB 的疗效及作用机理。

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