胰岛素样生长因子⁃1对APP／PS1双转基因小鼠脑内Aβ1⁃40沉积的影响

宋芳芳 姜礼红 么晓轶 孟松艳

胰岛素样生长因子⁃1对APP／PS1双转基因小鼠脑内Aβ1⁃40沉积的影响

宋芳芳 姜礼红 么晓轶 孟松艳

目的以SPF级APP／PS1双转基因小鼠（22周）为阿尔茨海默病（AD）动物模型，皮下注射胰岛素样生长因子⁃1（IGF⁃1），观察其对AD模型小鼠脑内淀粉样蛋白（Aβ1⁃40）表达的影响。方法将APP／PS1双转基因小鼠及隐性基因小鼠分为4组，设立隐性基因组、隐性基因治疗组、转基因组及转基因治疗组。隐性基因治疗组、转基因治疗组分别皮下注射IGF⁃1［50μg／（kg·d）］，共8周。随后，各组行免疫组化方法观察小鼠脑内Aβ1⁃40的表达。结果转基因组及转基因治疗组可见神经元缺失。同转基因组比较，无论是皮质区还是海马区，转基因治疗组脑内Aβ1⁃40的表达均明显减少（P＜0.05）。结论IGF⁃1有降低APP／PS1双转基因小鼠脑内Aβ1⁃40表达的作用，具有阻断和延缓AD模型脑内老年斑形成的作用，尤其是对皮质区的Aβ1⁃40表达的阻断更为明显。

淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；胰岛素样生长因子⁃1；APP／PS1双转基因小鼠

阿尔茨海默病（AD）是中枢神经系统进行性变性疾病，脑神经细胞之间形成老年斑是其重要的病理特征。老年斑的主要成分是Aβ的沉积，能对细胞造成毒性损害，是导致患者脑功能障碍的主要原因。

胰岛素样生长因子⁃1（insulin⁃like growth factor，IGF⁃1）结构类似胰岛素，具有刺激多种细胞增殖、分化、迁移、存活、代谢等的作用。可调节神经细胞的生长和分化，对维持脑的正常功能起着重要作用。IGF⁃1可抑制细胞凋亡，有助于神经细胞受损后的功能恢复，现已被确认为一种神经营养因子，在神经系统有重要的营养保护作用。IGF⁃1可通过血脑屏障进入中枢神经系统，通过脉络丛的上皮细胞或转运体调节进入中枢神经系统的含量［1］。本实验利用APP／PS1双转基因小鼠模型，皮下注射IGF⁃1作为早期干预治疗，对皮质区Aβ1⁃40表达进行了观察，探讨IGF⁃1对AD的保护作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 重组人IGF⁃1（Prospec公司），抗Aβ1⁃40多克隆抗体（Abcam公司提供）。

1.2 实验动物和分组 SPF级APP／PS1双转基因小鼠及隐性基因小鼠各16只（南京大学模式动物研究所提供），雌雄各半，22周龄，体质量（32±6）g，分笼饲养，每笼1只，室内常温下配方饲料喂养，自由饮食水。将小鼠随机分为4组，隐性基因组、隐性基因治疗组、转基因组、转基因治疗组，每组8只。隐性基因组及转基因组：不进行任何处置；隐性基因治疗组及转基因治疗组：腹部皮下注射IGF⁃1［50μg／（kg·d）］，用药8周。

1.3 免疫组织化学 用10%水合氯醛麻醉小鼠，打开胸腔，经升主动脉快速灌注生理盐水，直至右心房流出液清亮为止。然后用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑。投入4%多聚甲醛溶液中固定，做冠状切面，固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，3%H2O2室温10 min灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次，滴加正常血清封闭液，室温20 min，甩去余液，不同的切片分别加入Aβ1⁃40抗体（一抗稀释浓度均为1∶2000），4℃湿盒内过夜。滴加山羊抗兔IgG抗体⁃HRP多聚体，37℃20 min，PBS洗3次，每次3 min，用DAB显色，常规脱水、透明、封片。

1.4 计数方法与统计学处理 以神经细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒沉着为阳性结果。每组取8张脑片，每张切片皮质区及海马区分别取10个高倍视野，计数每个视野Aβ1⁃40免疫组化阳性细胞数，取其均值。所有数据以均数±标准差（s）表示，全部数据采用SPSS 19.0软件分析，组间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ1⁃40免疫阳性细胞数比较 隐性基因组皮质区与海马区Aβ1⁃40免疫阳性细胞数存在差异（P＝0.01），IGF⁃1治疗对隐性基因小鼠Aβ1⁃40沉积作用不明显（P＝0.388）。皮质区隐性基因组和隐性基因治疗组Aβ1⁃40免疫阳性细胞数无统计学差异（P＝0.677），海马区隐性基因组和隐性基因治疗组Aβ1⁃40免疫阳性细胞数无统计学差异（P＝0.419）。

转基因组皮质区与海马区Aβ1⁃40沉积存在统计学差异（P＝0.002），皮质区Aβ1⁃40免疫阳性细胞数相对较多；同转基因组比较，无论是皮质区还是海马区，转基因治疗组Aβ1⁃40免疫阳性神经元均有所减少；IGF⁃1对两区域治疗效果也存在差异（P＜0.01）。见表1。

2.2 镜下观察 转基因组及转基因治疗组可见部分神经元缺失，细胞排列疏松紊乱，老年斑形成，可见大量棕褐色阳性细胞，胞质及轴突、树突均清晰着色，转基因治疗组老年斑相对较少；隐性基因组及隐性基因治疗组海马区偶见Aβ1⁃40免疫阳性神经元。见图1～8。

表1 各组Aβ1⁃40免疫阳性神经元数值比较（阳性细胞数／100个细胞，s，n＝8）

表1 各组Aβ1⁃40免疫阳性神经元数值比较（阳性细胞数／100个细胞，s，n＝8）

注：与皮质区比较，∗∗P＜0.01；与转基因组比较，△△P＜0.01

组别皮质区海马区隐性基因组5.64±1.07 4.11±0.94∗∗转基因组58.31±6.48 48.05±9.50∗∗隐性治疗组5.39±1.33 3.63±1.37∗∗转基因治疗组46.31±5.16 38.83±6.99∗∗△△

图1 隐性基因组皮质区Aβ1⁃40表达（×20）

图2 转基因组皮质区Aβ1⁃40表达（×20）

3 讨论

多项实验提示IGF⁃1在老年性痴呆的治疗中可能具有一定的临床价值，IGF⁃1及其受体能调节乙酰胆碱的合成与释放［2］，抑制蛋白的高度磷酸化［3］，可改善老龄动物的记忆、学习能力［4］，从而揭示了IGF⁃1影响认知功能的可能机制。相反，给予IGF⁃1抗体的大鼠学习记忆能力显著下降［5］。这些发现使IGF⁃1信号系统在AD发病机制中的作用研究迅速扩展开来。目前对于IGF⁃1在AD中的作用有了一定的认识，但结论尚未统一。本实验采用APP／PS1双转基因小鼠为AD动物模型，该品系小鼠在出生后4月龄时就可观察到老年斑形成，随着月龄增长，脑内老年斑堆积增加，逐渐出现认知功能障碍，因此选择该动物模型，实验数据不易受人为因素的影响。选择对转基因鼠进行早期干预治疗，以探讨IGF⁃1对Aβ早期生成、凝聚过程的作用机制。实验发现，7月龄APP／PS1双转基因小鼠皮质区出现部分神经元缺失，细胞排列疏松紊乱，可见大量棕褐色Aβ1⁃40阳性细胞，有老年斑形成，海马区颗粒细胞带轻度受损，神经元排列尚规则。应用IGF⁃1治疗后，与转基因组比较，转基因治疗组小鼠脑内Aβ1⁃40水平明显降低，老年斑形成减少，表明IGF⁃1能降低APP／PS1双转基因小鼠脑内Aβ1⁃40的表达，具有阻断和延缓AD模型脑内老年斑形成的作用。据此推论，IGF⁃1皮下

注射，使APP／PS1双转基因小鼠Aβ1⁃40表达减少，可能是延缓AD病程进展、改善AD认知功能的机制之一，早期的IGF⁃1干预治疗可能对延缓AD病程进展更行之有效。IGF⁃1对APP／PS1双转基因小鼠皮质区及海马区Aβ1⁃40表达的作用也存在差别，尤其是对皮质区的Aβ1⁃40表达的阻断更为明显，这可能与不同区域IGF⁃1的敏感程度不同有关。实验用药时间共8周，更长时间的IGF⁃1药物治疗对Aβ1⁃40表达的作用及对老年斑形成的影响，还需要更进一步的研究。尽管IGF⁃1真正应用于临床治疗AD还需要克服很多难题，相信将来IGF⁃1可能成为治疗AD的新途径。

图3 隐性基因治疗组皮质区Aβ1⁃40表达（×20）

图4 转基因治疗组皮质区Aβ1⁃40表达（×20）

图5 隐性基因组海马区Aβ1⁃40表达（×20）

图6 转基因组海马区Aβ1⁃40表达（×20）

图7 隐性基因治疗组海马区Aβ1⁃40表达（×20）

图8 转基因治疗组海马区Aβ1⁃40表达（×20）

IGF⁃1与中枢神经系统的关系存在两面性。一方面它作为神经营养因子具有延缓AD的作用［6⁃7］，但另一些实验结果则恰恰相反，特别是针对Aβ代谢和毒性的研究中［8⁃9］。所以目前关于IGF⁃1与AD关系尚没有定论，也正因为如此，值得更多和更细致的研究。

［1］ Bolos M，Fernandez S，Torres⁃Aleman I.Oral administration of aGSK3 inhibitor increases brain insulin⁃like growth factor I levels［J］.JBiol Chem，2010，285（23）：17693⁃17700.

［2］ Selkoe DJ.The cell biolgy of beta⁃amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer's disease［J］.Trends Cell Bio，1998，8（11）：447⁃453.

［3］ Hong M，Lee VW.Insulin and insulin⁃like growth factor⁃Ⅰregulate tau phoshorylation in cultured human neurons［J］.J Biol Chem，1997，272（31）：19547⁃19553.

［4］ Sonnag WE，Lynch C，Thomton P，et al.The effects of growth hormone and IGF⁃Ⅰdefficency on cerebrovascular and brain ageing［J］.JAnat，2000，197（4）：5755⁃5785.

［5］ de la Monte SM，Wands JR.Alzheimer⁃associated neuronal thread proteinmediated cell death is linked to impaired insu⁃lin signaling［J］.JAlzheimers Dis，2004，6（3）：231⁃242.

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［7］ Gasparini L，Gouras GK，Wang R，etal.Stimulation of beta⁃amyloid precursor protein trafficking by insulin reduces intra⁃neuronal beta⁃amyloid and requires mitogen⁃activated protein kinase signaling［J］.JNeurosci，2001，21（8）：2561⁃2570.

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［9］ Cohen E，Bieschke J，Perciavalle RM，et al.Opposing ac⁃tivities protect against age⁃onset proteotoxicity［J］.Science，2006，313（5793）：1604⁃1610.

Effects of insulin⁃like grow th factor⁃1 on reducing over⁃expression of Aβ1⁃40in the brain of APP／PS1 double trans⁃genic mouse

SONG Fang⁃fang，JIANGLi⁃hong，YAO Xiao⁃yi，MENGSong⁃yan．DepartmentofGeriatrics，the Second Af⁃filiated Hospital ofHarbin Medical University，Harbin 150086，China

ObjectiveTo investigate the effects of subcutaneous injection of insulin like growth factor⁃1（IGF⁃1）on the expression of amyloid protein（Aβ1⁃40）in the APP／PS1 double transgenic mice.MethodsAPP／PS1 double trans⁃genicmice and recessivemicewere respectively divided into 4 groups，the establishmentof recessive genome group，reces⁃sive gene therapy group，genome group and transgenic therapy group.Subcutaneous injection of IGF⁃1［50μg／（kg·d）］were given to both the recessive gene therapy group and transgenic therapy group.After 8 weeks，the expression of the Aβ1⁃40in the cortical area and hippocampal area ofmouse was detected by immunohistochemicalmethods.ResultsThe genome group and transgenic therapy group also exhibited irregular arrangement of neuron units.The expression of Aβ1⁃40in the cortical and hippocampal area in the transgenic therapy group was significantly lower than that in genome group（P＜0.05）.ConclusionsThrough decreasing the expression of Aβ1⁃40in the cortical and hippocampal area，IGF⁃1might in⁃hibit the damage induced by Aβ1⁃40in the AD micemodel.

amyloid protein；Alzheimer's disease；insulin like growth factor⁃1；APP／PS1 double transgenicmouse

R 749.16 ［

］ A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.11.009

2014⁃01⁃14）

黑龙江省留学归国科学基金项目（LC2009C13）

150086黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学第二附属医院第四住院部干部五病房

姜礼红，Email：1551482485＠qq.com