羊传染性脓疱病毒基因组结构和主要基因功能研究进展

成伟伟，张克山，刘永杰，孔汉金，尚佑军，刘湘涛，刘 磊

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）

羊传染性脓疱（俗称羊口疮）是由痘病毒科、副痘病毒属的羊传染性脓疱病毒又称羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种人兽共患传染病［1］，其特征为绵羊和山羊口、唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤与黏膜形成水疱、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂［2］，该病以直接接触和间接接触传染，主要危害3月龄～6月龄的羔羊和部分成年羊，羔羊发病率可达90%以上［3］。该病呈世界性分布，且广泛流行［4］，在我国以西部地区流行较广泛，是家畜疫病防控中的重要疫病之一。由于近年来肉羊产业发展迅速，而该病危害严重，给养羊业带来了巨大的经济损失。

羊传染性脓疱病毒（羊口疮病毒）粒子呈椭圆形毛线团样外观，长220nm～300nm，宽140nm～200nm，表面为“8”字型缠绕的螺旋结构［5］。基因组为线性双链DNA，大小为134kb～139kb，中间是大的中央编码区，两端为反向末端重复序列（ITRs）形成的共价闭合的发卡结构［6］。目前公认ORFV基因组包含16个开放阅读框，约134个基因，其中127个为线性基因，基因组的G＋C含量可达63%～64%。基因组中央核心区（ORFV 009～111）相对保守主要包括与病毒复制和病毒粒子在细胞浆中装配成熟有关的基因，主要调控病毒的复制、包装和释放。两端（ORFV 001～008和ORFV 112～134）主要由与病毒的毒力、宿主范围、免疫逃避及免疫调节有关的基因组成［7］。目前对于ORFV基因组结构及功能还不十分清楚，本文综述了近年来ORFV研究进展，阐述了ORFV基因组结构及功能，以期对从事ORFV研究人员有所帮助。

1 ORFV基因组5′反向末端重复序列（ITR s）区主要基因及功能

1.1 ORFV 002基因

ORFV 002基因编码的蛋白具有抑制核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的作用，NF-κB广泛存在于各种细胞中，具有多种应激原。核因子κB抑制蛋白（inhibitor kappa B ，IκB）是 NF-κB的特异性抑制物，IκB激酶催化IκB的磷酸化，磷酸化的IκB能够激活NF-κB。目前认为 NF-κB信号通路的主要过程为：NF-κB与IκB结合以无活性的形式存在于细胞质中，当机体遭受病毒感染等因素刺激时，产生的各种激活诱导物（如细胞因子）与相应细胞表面受体结合，募集肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）等结合蛋白，激活下游的激酶如 NF-κB诱导激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）等。这些激酶并不直接磷酸化IκB，而是将信号继续传递至核因子κB抑制蛋白激酶（inhibitor kappa B kinase，IκK），由后者负责磷酸化IκB。磷酸化的IκB并未与 NF-κB解离，而是迅即与泛素结合，引发IκB的泛素化并为26S蛋白酶体所识别而降解，暴露出 NF-κB核定位信号和DNA结合结构域，NF-κB入核并结合于特定基因的转录激活区，激活特定基因转录［8］。ORFV 002基因编码的蛋白通过干扰NF-κB-p65与NF-κB-p300之间的联系而降低NF-κB-p65的乙酰化，从而抑制NF-κB的信号通路［9］。ORFV 024基因和121基因也同样具有抑制NF-κB的作用，但作用机制有所差异，ORFV 024基因是通过逐步结合在IκK复合物的上游来抑制IκB激酶IκKα和IκKβ的磷酸化，ORFV 121基因的抑制机制是ORFV 121基因编码的蛋白在细胞浆中和NF-κB-p65结合抑制了NF-κB-p65的磷酸化和核转运，从而抑制了免疫相关基因的转录和翻译［10］。

1.2 ORFV 007基因

对于ORFV 007基因（dUTPase基因）及其编码的脱氧尿苷焦磷酸酶 （dUTP pyrophosphatase，dUTPase）的功能活性Cottone R等［11］通过研究发现，ORFV 007基因是一个毒力基因，而对于缺失编码dUTPase的基因或dUTPase活性低的病毒株，其对机体的致病性明显降低，它很可能是由于该基因的缺失导致病毒在复制过程中出现了缺陷。

1.3 其他基因

ORFV 003、004、008基因是与决定宿主范围有关的基因［7］，且均编码锚蛋白重复序列（ankyrinrepeat，ANK），ANK是普遍存在于生物体中的一种蛋白质序列模体，F盒样蛋白（F-BOX）基序已经证明存在于大多数痘病毒的ANK中，它参与了宿主细胞的泛素∕蛋白酶体机制［12］。ORFV编码的这些ANK通过F-BOX蛋白基序介导作用降解宿主抗病毒因子，为ORFV的复制和跨种感染提供便利。ORFV共编码7个ANK，在ORFV基因组3′ITRs的123、126、128、129基因也同样编码 ANK。ORFV 006基因是与ORFV毒力相关的基因 ，而ORFV 001和005基因及编码的蛋白的功能目前尚不清楚。

2 ORFV基因组中央核心区主要基因及功能

2.1 ORFV 011基因

ORFV 011基因（B2L基因）长1 137bp，编码的B2L蛋白大小为41.67ku，B2L蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白与牛痘病毒（Vaccinia virus，VACV）的主要囊膜蛋白p37k的氨基酸同源性为42%［13］。ORFV B2L基因比较保守编码的B2L蛋白可刺激机体产生强烈的抗体反应，是ORFV的保护性抗原之一。ORFV编码的B2L蛋白具有良好的免疫原性，这将在ORFV疫苗构建方面起到重要作用。

2.2 ORFV 020基因

干扰素（interferon，IFN）的抗病毒作用主要是通过病毒与宿主在相互作用的过程中，宿主细胞会产生蛋白激酶（protein kinase，PKR），PKR可以被细胞内的dsRNA或病毒复制中间体激活，而激活的PKR可以使翻译起始因子2的α亚单位（the alpha subunit of the the initiation factor，eIF-2α）磷酸化，从而导致病毒蛋白的合成不能启动，达到抑制病毒复制的目的［14］。ORFV的干扰素抑制基因（Orf virus interferon resistance gene，OVIFNR基因）是一种先进的抗IFN功能基因，编码早期抗IFN的蛋白。蛋白能够通过其羧基末端一段保守的基序竞争性结合dsRNA和病毒复制中间体，这样就抑制了IFN诱导的PKR的激活，从而阻止宿主细胞IFN发挥 终 止 病 毒 蛋 白 翻 译 的 作 用［15］。ORFV 的OVIFNR基因与VACV的E3L基因的同源性为31%，而编码的氨基酸的同源性为57%。研究发现，体外用OVIFNR取代VACV的E3L，不会影响VACV的复制，但体内致病力会严重受挫［16］。

2.3 ORFV 059基因

ORFV 059基因（F1L基因）位于ORFV基因组中部，长度为1 005bp，是一个完整的开放阅读框，其编码产生的39ku蛋白是ORFV表面微管的组成成分之一，并且能诱导宿主产生中和抗体，同时也能介导细胞免疫，因而该蛋白被认为是刺激机体产生免疫应答的主要免疫原蛋白［17］。该蛋白具有肝素结合活性，能够与表达于大多数哺乳动物细胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）受体结合，因此该蛋白被认为在病毒吸附和侵入过程中起到重要作用［18］。

2.4 其他基因

ORFV 080基因编码产生的蛋白与VACV A4L基因编码产生的后期蛋白具有相似功能，其在病毒粒子核心蛋白的形成以及形态发生过程中起到了重要作用［7］。

ORFV 086基因是一个高度保守的晚期基因。研究表明，19ku和70ku两个多肽都是ORFV 086基因编码的蛋白（病毒核心蛋白p4a前体蛋白）的片段，这两个片段在Glu-490至Arg-590区域间存在重叠，表明ORFV 086基因编码的蛋白的水解位点可能定位于这一区域［19］，ORFV 086基因编码的蛋白与VACA编码的p4a蛋白同源，VACA编码的p4a蛋白为病毒含量最多的结构蛋白，大约占病毒粒子重量的14%。

3 ORFV基因组3′反向末端重复序列（ITRs）区主要基因及功能

3.1 ORFV 112基因

ORFV 112基因编码一种趋化因子结合蛋白（chemokine binding protein，CBP蛋白），在病毒感染宿主的早期，趋化因子主要诱导白细胞向病毒感染部位聚集，根据趋化因子氨基端半胱氨酸残基的排列，可将其分为4种类型，即CXC、CC、CX3C和C，其中X代表任意一种氨基酸残基，它们是调节炎症和免疫反应的关键物质。ORFV编码产生的CBP蛋白结构和功能与正痘病毒属及黏液瘤亚群病毒属病毒的Ⅱ型CBP蛋白相似，与CC-趋化因子（单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白-1a和RANTES）有高度的亲和性，CBP蛋白与CC-趋化因子结合后能抑制单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞向感染部位集聚，与其他Ⅱ型CBP蛋白不同的是，ORFV编码的CBP蛋白也可以与属于C-趋化因子的淋巴细胞趋化因子结合，并通过XCR1受体抑制T、B细胞以及其他淋巴细胞向感染部位聚集［20-21］。

3.2 ORFV 117基因

ORFV 117基因仅副痘病毒属成员具有，该基因编码产生的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）抑制因子（inhibitor of granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GIF）可以与细胞因子GM-CSF和白介素-2（IL-2）结合并抑制其生物活性［22］。这段基因序列很可能是病毒与宿主在相互适应过程中由于基因重组而获得，有研究表明ORFV编码的GIF蛋白在结构和功能上类似于Ⅰ型细胞因子受体家族。ORFV编码的GIF蛋白与Ⅰ型细胞因子受体中也存在相似的结构，半胱氨酸残基和 WDPWV基序，WDPWV基序属于WSXWS基序（其中X可代表任意氨基酸），对ORFV编码的GIF蛋白进行定点突变表明二硫键和WDPWV序列是其维持生物学活性所必需的结构［23］。

3.3 ORFV 125基因

在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用。ORFV 125基因编码的蛋白与抑制细胞凋亡有关，该蛋白能够抑制紫外线引起的Bcl-2家族成员Bax和Bak凋亡的激活，是Bcl-2的抑制因子，也是副痘病毒属第一个被证实的抑制细胞凋亡的蛋白［24］。

3.4 ORFV 127基因

ORFV 127基因编码的白介素-10（virus interleukin-10，vIL-10）通常为185个氨基酸，大小约21.7ku。是ORFV早期表达的基因之一，ORFV毒株NZ2编码的vIL-10与其他物种编码的白介素10（interleukin-10，IL-10）的氨基酸同源性如下：绵羊（80%）、牛（75%）、人（67%）、鼠（64%）、人类疱疹病毒Ⅳ型（63%），马疱疹病毒（67%）。vIL-10能抑制Th1细胞的增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ和GM-CSF等细胞因子的合成以及巨噬细胞、淋巴细胞和角质细胞分泌 TNF-α、IL-8和IFN-γ［25］。ORFV vIL-10基因在病毒成功感染宿主过程中起到了重要作用。

3.5 ORFV 132基因

ORFV的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因是其早期翻译的重要毒力基因之一，ORFV各毒株编码的VEGF差异较大，Mercer A等［26］检测了21株不同来源的ORFV编码的VEGF发现其中大多数与NZ2毒株编码的VEGF相似，但预测的氨基酸序列相互间的突变率却达到30.8%，ORFV的VEGF基因具有易变性，而ORFV各毒株编码的VEGF都保守有功能相关结构，与其他类型的VEGF具有相似功能，能促使表皮细胞增生，引起宿主血管内皮细胞增殖和毛细血管通透性增加等广泛的血管变化。

4 展望

研究发现中央核心区B2L和F1L基因编码的蛋白能够诱导机体产生中和抗体，这对ORFV疫苗的研制具有重要作用。ORFV作为副痘病毒属的代表成员，已进化出了一整套免疫逃避机制。ORFV的OVIFNR基因、CBP基因、GIF基因、vIL-10基因和VEGF基因在病毒抵抗宿主的免疫反应过程中发挥重要作用。ORFV在与宿主相互作用过程中不断进化，目前对许多ORFV功能基因以及与宿主相互作用的精细程序还远远不为我们所探知，如ORFV基因组中还有约25个致病相关基因的结构和功能尚不明确。ORFV具有丰富的功能基因以及在免疫逃避方面表现出了精细的调节机制，这为深入研究ORFV的致病机理和免疫逃避机制奠定了基础和锁定了目标。ORFV基因组两端的一些毒力基因表现出了丰富的功能特点，如OVIFNR的抗干扰素活性，CBP的趋化因子结合活性，VEGF的促血管增生功能。深入研究ORFV的基因组两端的毒力基因将有助于ORFV的新型疫苗研制和为抗病毒药物的研究打下基础。

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