非洲猪瘟病毒检测方法研究进展

张 玉，谢银禄，张国庆

（1.青海省大通县长宁镇后子河兽医站，青海大通810105；2.青海省海西州格尔木市畜牧兽医站，青海格尔木816000；3.青海省大通种牛场，青海大通810100）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病［1］，临床症状类似于经典猪瘟（Classical swine fever，CSF），主要特征表现为高热、呕吐、皮肤发绀、内脏器官广泛性出血、呼吸障碍、流产及神经系统功能改变等［2-3］。ASF于1921年在非洲肯尼亚被首次发现，目前已流行至非洲、欧洲和美洲等数10个国家和地区，且仍有不断蔓延的趋势［4-6］。该病传染性强、发病快、病程短、病死率高达100%，对养猪业危害极大，该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须及时通报的动物疫病，被我国农业部列为一类动物疫病［7］。目前，该病的防控缺乏行之有效的疫苗和治疗药物，综合防控面临着巨大挑战。在我国虽未发现该病，但其从西非至东非、欧洲、亚洲的传播态势已经形成，对我国养猪业的潜在威胁日益增大，一旦侵入我国，将会给我国养猪业带来极大的危害，并对养猪相关产业造成巨大冲击。只有建立快速、准确、灵敏和特异的ASFV检测方法，才能更好地进行检疫，严防该病传入我国，故加强该病快速诊断技术的研究贮备工作具有重大的现实意义。论文就非洲猪瘟病毒各种实验室检测技术优缺点进行全面论述，旨在为我国开展非洲猪瘟的监测提供技术参考。

1 PCR及多重PCR方法

PCR方法操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性强，是实验室常用的分子生物学诊断技术，也是目前ASFV较常用的实验室诊断方法。多重PCR方法是在同一个PCR反应体系中加入多对特异性检测引物，同时对多个靶基因进行快速扩增，其可以实现ASFV与其他病原体的快速鉴别诊断。

Aguero M等［8］和曾少灵等［9］均先后建立了ASFV的PCR检测方法，均具有良好的敏感性和特异性，可以检测出极低含量的ASFV，为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。杨霞等［10］利用PCR方法对河南省不同地市27个猪场所采集的疑似病料进行了ASFV的核酸检测，阳性检出为0，表明中国河南地区没有ASFV的感染与流行。PCR方法操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强，适合普通实验室进行ASFV的检测工作，对实现ASFV早期排查具有重要意义。

Aguero M等［11］和张倩等［12］分别建立了检测ASFV和CSFV的双重PCR方法，Aguero M等建立的方法从临床样品处理至检测结束整个过程在5h内即可完成，张倩等建立的方法检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒均为阴性，对CSFV和ASFV的最低检出量均可以达到100pg，对山东聊城地区58份样品进行检测，CSFV阳性15份，ASFV阳性0份。多重PCR方法可在同一个体系中同时对多个目的基因进行扩增，并且检测所耗时间与常规PCR方法相当，同样适合于普通实验室，为ASFV和CSFV的临床鉴别诊断和流行病学调查等研究提供了有效的技术支持。

2 荧光定量PCR及多重荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR（real-time quantitative-PCR，real-time qPCR）是融汇了PCR技术和光谱技术的一种核酸定量检测技术，具有敏感性高、特异性强、重复性好、全封闭反应、定量准确等优点，与常规RT-PCR检测方法相比，解决了PCR假阳性和溴化乙锭对环境的污染问题，且可以实现定量检测。多重荧光定量PCR方法是在同一个荧光定量PCR反应体系中加入多对特异性检测引物，进而多种病原体的鉴别诊断。

Fernandez Pinero J等［13］利用通用探针库建立了ASFV的实时荧光定量PCR检测方法，实现了ASFV感染的定量检测和鉴定。黄萍等［14］和郭少平等［15］分别针对ASFV p72基因和K205R基因设计特异性检测引物和探针，均建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法，其敏感性可达100个拷贝。实时荧光定量PCR检测方法敏感性高、特异性强，可同时快速检测大批量样品，且整个反应在密闭条件下进行，相对不易产生分子污染，可作为ASFV的诊断、检疫、食品安全检验和ASFV分子生物学研究的一种定量检测方法。

Haines F J等［16］和陈静静等［17］分别建立了可以同时检测CSFV和ASFV的荧光定量PCR鉴别检测方法，检测口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水疱病病毒、猪圆环病毒2型均为阴性，灵敏度可以达到10拷贝的数量级，对2份已知CSFV阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品进行检测，阳性样品的检测结果均为阳性，未知样品检出CSFV 3份阳性，未检出ASFV阳性。CSFV和ASFV双重荧光定量PCR鉴别检测方法，只需一步操作即可完成CSFV和ASFV的鉴别诊断，且敏感性比常规的CSFV和ASFV双重PCR鉴别检测方法要高，适用于ASFV和CSFV的临床快速鉴别诊断和定量检测。

3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新兴的核酸扩增技术，可以实现等温条件下的核酸快速扩增，该方法操作简单、灵敏、快速，且不需要特殊仪器设备，具有较高的临床实用性。James H E等［18］和江彦增等［19］均建立了快速、高效检测ASFV的LAMP方法，该方法在恒温水浴锅中进行，30min即可得到结果，灵敏度是常规PCR方法的100倍以上，非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测ASFV。杨吉飞等［20］利用建立的ASFV的LAMP方法对非洲猪瘟参考实验室提供的ASFV 17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测，结果显示LAMP方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组，而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。LAMP检测方法不需要PCR中的变性、退火步骤即可进行靶序列的循环扩增，不但大大缩短了时间，且使反应能够在恒温条件下进行，无需特殊仪器设备，肉眼判读，可以满足基层快速诊断的需要，非常适合于基层兽医实验室和养殖场使用。

4 探针杂交技术

探针技术是用探针标记已知核酸序列，通过检测标记探针信号而分析核酸含量，进而可用于特定基因序列的检测。张鑫宇等［21］针对ASFV p72基因分别设计合成1条与保守区域互补的5′生物素标记及3′烷巯基修饰短链寡核苷酸探针，并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上，制备纳米金标记探针，将PCR扩增产物与生物素探针及纳米金标记探针进行杂交，杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板，利用亲和原理，捕获杂交产物，银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大，进而建立了检测ASFV p72基因的纳米金探针杂交方法。该方法中纳米金探针经银染放大后，在酶标板中形成肉眼可见的黑色沉淀，可有效检测扩增出核酸浓度达到10fmol/L p72基因，可用于ASFV快速检测。探针技术检测灵敏度高，同时能有效排除PCR检测过程中的非特异性结果，省去了琼脂糖凝胶电泳步骤，操作简便、检测迅速，在酶标板中可以批量反应，为ASFV核酸检测方法研究开辟了新的途径，但该方法的建立难度较高，操作较繁琐，对试验人员技术水平要求较高。

5 ELISA方法

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是继免疫荧光和放射性同位素免疫技术之后发展起来的一种新型的免疫酶技术，具有检测快速、操作简单、无辐射、价格低廉等优点，是当前动物疫病诊断与流行病学调查广泛采用的免疫学诊断技术。Perez Filgueira D M等［22］以昆虫细胞表达的p30重组蛋白为包被抗原，建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法，通过对采自西班牙和不同非洲地区的672份猪血清样品进行检测表明，间接ELISA方法敏感性高，可检测到ASFV早期感染的样品，可用于ASFV特异性抗体的早期检测。董志珍等［23］利用基因重组技术制备非洲猪瘟p54蛋白，将其免疫Balb/c小鼠，将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用有限稀释法进行克隆，获得一株能稳定分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，使用该单克隆抗体建立了检测猪血清中ASFV抗体的竞争ELISA方法，该方法灵敏度高于间接免疫荧光方法，可用于猪血清的ASFV抗体检测。曾少灵等［24］利用杆状病毒表达载体成功表达了ASFV VP73蛋白，表达的重组蛋白具有良好的特异性与反应性，以此重组蛋白作为检测抗原，建立了检测ASFV血清抗体的间接ELISA方法。张倩等［25］采用瑞典SVANOVA非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒对辽宁绥靖、内蒙古赤峰、大连东港共计92份猪血清进行了ASFV抗体的检测，结果全部为阴性。ELISA方法高通量、快速、简单、敏感、特异、无污染，非常适用于基层兽医部门进行大批量样品检测和大规模流行病学调查。

6 小结

非洲猪瘟在我国尚未发现，是我国进出口贸易中监测的重要疫病，必须保持高度警惕，防止该病入境。近年来，随着国际贸易、现代物流的飞速发展、世界经济的全球化、自然生态环境的改变，ASFV从西非至东非、欧洲、亚洲传播的态势已经形成，传入我国的风险加剧，加强该病诊断技术的研究贮备工作具有重要意义。目前，针对ASFV的检测技术主要有针对病毒核酸检测技术和基于病毒抗原/抗体反应的免疫学技术。用免疫学方法检测抗体可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，故ELISA等抗体检测方法存在一定的局限性。PCR、荧光定量PCR、LAMP等分子生物学技术在猪感染ASFVV的早期即可检测到病毒核酸，在ASFV的早期检测中具有重要作用。其中PCR方法操作简单、灵敏度高、重复性好，需要一定的仪器设备和试剂，适合一般实验室使用。荧光定量PCR方法将PCR与荧光检测结合起来，克服了常规PCR易污染、扩增后需电泳检测等缺点，并可对病毒核酸进行准确定量，且检测灵敏度比常规PCR方法更高，但荧光定量PCR方法对操作人员、仪器设备与试剂要求较高，一般实验室很难具备试验条件，难以普及应用。LAMP方法肉眼判读、操作简单、不需要特殊仪器设备，特别适合于基层兽医实验室和养殖场应用。总之，ASFV的实验室检测方法各有优缺点，但对各种方法的检测结果均要求准确、快速、敏感，以便采取及时、有效的防控措施。相信随着分子生物学与免疫学技术的不断发展，ASFV实验室诊断方法必将会不断完善，进一步为我国开展非洲猪瘟的监测与综合防控提供技术支持。

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