新城疫病毒实时荧光RTLAMP检测方法的建立*

陈 兵，胡运发，孙 洁，陈书琨，刘建利，曾少灵，曹琛福，张彩虹，阮周曦，林庆燕，吕建强，杨俊兴，花群义，卢体康，秦智锋＊

新城疫病毒实时荧光RTLAMP检测方法的建立*

陈 兵1，胡运发1，孙 洁2，陈书琨1，刘建利2，曾少灵1，曹琛福2，张彩虹2，阮周曦2，林庆燕1，吕建强1，杨俊兴1，花群义1，卢体康1，秦智锋1＊

（1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳 518045；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳 518001）

新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病，建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA，在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上，建立新城疫病毒（NDV）实时荧光反转录环介导等温扩增（rRT-LAMP）检测法，并对该法进行特异性、敏感性及准确性分析。试验结果显示，本试验所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鉴别NDV，其敏感性可检测至50个基因拷贝，与国家标准实时荧光定量RT-PCR检测法一致；该法特异性强，与AIV、IBV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应。小规模田间试验显示，该法用于NDV的普查监测，结果可靠。结果表明，建立的NDV-rRT-LAMP检测法可满足NDV现场快速分子检测需求。

新城疫病毒；实时荧光反转录环介导等温扩增；现场检测

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一类主要感染禽类的烈性传染病，是我国重点防控的重大动物疫病［1］。发病率和病死率较高，是危害养禽业的一种主要传染病［16－18］。建立适合基层和现场使用的快速灵敏的分子生物学检测方法，成为相关部门防控该病的重要技术支撑［1］。

LAMP自2000年发明以来，在各个核酸检测领域进行了大量的使用［2－5］。本实验室已初步建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法［6］和H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-LAMP检测法［7］，并得到了一定的应用。在此基础上，建立了基于现场热裂解抽提核酸的 NDV RT-LAMP（real-time RT-LAMP，rRT-LAMP）检测法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准毒株 新城疫病毒标准强毒株F48E9（NDV-F48E9）、新城疫凝集抗原（NDV-HI）、新城疫Ⅰ系疫苗（Mukteswar株，NDV-Ⅰ））、新城疫Ⅳ系疫苗（La Sota株，NDV-Ⅳ）、H5亚型禽流感抗原（AIV-Re-6）、传染性支气管炎活疫苗（IBV-LDT3-A株）、传染性法氏囊病活疫苗（IBDV-Gt株）等抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.1.2 主要仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪，EZ1核酸抽提仪，ESEQuant Tube Scanner仪；RNase free H2O（TaKaRa），10× Bst polymerase buffer（New England Biolabs），large fragment Bst DNA polymerase（New England Biolabs），AMV（TaKaRa），25mmol／L MgSO4（TaKaRa），Betaine（Sigma），10mmol／L dNTPs（Sigma），500μmol／L MnCl2（Sigma），EZ1Viral RNA Mini Kit v2.0（Qiagen），qRT-PCR Kit（Applied Biosystems），Calcein（Fluka）。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 融合蛋白基因（F基因）是新城疫病毒的重要免疫原蛋白基因，对新城疫的诊断具有重要意义。本试验根据GenBank中NDV F基因的核苷酸序列，使用DNA Star分析选出6个高特异性的保守核苷酸区域，通过Primer Premier 5设计外引物（F3和B3）、内引物（FIP和BIP）等2对引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成，相应序列见表1。用前将1mmol／L各引物贮存液按FIP／BIP∶F3／B3∶LPF／LBF为8∶1∶4混匀备用。

1.2.2 NDV核酸抽提及克隆质粒的构建 用EZ1核酸抽提仪抽提 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ各毒株 RNA，洗脱体积为90μL。采用NDV-rRT-LAMP外引物F3和B3分别作为上游和下游引物，以 NDV-F48E9RNA为模板进行RTPCR扩增。反应程序为：50 ℃ 45min；95 ℃10min；94℃45s，56℃60s，72℃60s，共30个循环；72℃10min，4℃结束反应。分离纯化扩增产物，使用pMD18-T Vector构建pMD18-T-F重组质粒并测定浓度，置－20℃保存备用。

表1 NDV-rRT-LAMP检测引物Table 1 Primers for NDV-rRT-LAMP

1.2.3 NDV-rRT-LAMP检测方法 参考相关报道［6，7，14］，用 RNase free H2O 配 制 500 μmol／L MnCl2，25μmol／L Calcein储存液，二者按2.5∶1混匀作为Calcein工作液。取 NDV-F48E9、NDVHI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ 病 毒 尿 囊 液 各 20μL，于100℃热裂解2min，离心并取2μL作为模板。NDV-rRT-LAMP反应体系为25μL，其中10×Bst DNA buffer 2.5μL，Bst DNA Polymerase 1μL，Amv 1μL，Mg2＋0.6μL，dNTPs 3.5μL，Betaine 5μL，Primers mix 1μL，Calcein-Mn2＋1μL，RNase free H2O 8.5μL。反应体系混匀后瞬时离心，于ESEQuant Tube Scanner仪上63℃反应50min。同时设置阴性对照（无病毒尿囊液）和空白对照（RNase free H2O）。

1.2.4 NDV-rRT-LAMP可视化检测方法 重新进行1.2.3中的 NDV-rRT-LAMP反应。在制备反应液时，取0.5μL SYBR GreenⅠ作为染色剂，于反应前小心滴加于反应管盖内侧，小心操作避免掉入反应液，反应结束后颠倒反应管以混入染料，观察颜色变化。将反应液置于紫外灯下，观察颜色变化。

1.2.5 NDV-rRT-LAMP检测法的评价

1.2.5.1 NDV-rRT-LAMP敏感性试验 将 NDVHI抗原原液10倍系列稀释，热裂解法抽提核酸后同时进行 NDV-rRT-LAMP 和实时荧光 RT-PCR（real-time RT-PCR，rRT-PCR），对比2种检测方法的敏感性。将pMD○R18-T-H5从105拷贝开始进行10倍倍比稀释并进行NDV-rRT-LAMP，确定该法可检测的最低基因拷贝数。

1.2.5.2 NDV-rRT-LAMP特异性试验 取 NDVHI、AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病毒经核酸抽提仪抽提核酸，同时进行NDV-rRT-LAMP检测和可视化检测，评价该方法的特异性。

1.2.5.3 NDV-rRT-LAMP田间样品检测 随机采取鸡喉头／泄殖腔棉拭子浸出液20份，热裂解法抽提核酸并进行 NDV-rRT-LAMP；同时采用EZ1抽提RNA，参照新城疫实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行，探讨该方法的田间实用性及可靠性。

2 结果

2.1 NDV-rRT-LAMP实时荧光检测结果

以 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ直接热裂解模板为核酸，于仪器上进行实时检测。4个新城疫毒株检测结果均为阳性，出现实时扩增曲线；阴性尿囊液（NTC）和空白水对照（BTC）的检测结果为阴性，检测结果与预期相符（图1）。

图1 热裂解法NDV-rRT-LAMP实时荧光检测结果Fig.1 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.2 NDV-rRT-LAMP可视化检测结果

各毒株在仪器上实时荧光RT-LAMP检测结束后，取出肉眼观察，各反应管液比较清晰，很少观察到混浊沉淀。将反应液倒置，反应前将SYBR GreenⅠ预滴加于管盖内侧的0.5μL SYBR GreenⅠ混入反应液，观察发现 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ等实时荧光阳性的反应液呈现黄绿色，紫外光下为翠绿色；阴性尿囊液和空白水对照等实时荧光阴性反应液呈现为淡橙色，紫外光下为淡绿色（图2）。

图2 热裂解法NDV-rRT-LAMP肉眼检测结果Fig.2 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking observed with naked eyes

2.3 NDV-rRT-LAMP检测方法的评价结果

2.3.1 NDV-rRT-LAMP 敏感性试验结果 将NDV-HI 10倍系列稀释，热裂解法抽提核酸后直接进行 NDV-rRT-LAMP 和 rRT-PCR 检测。结果NDV-rRT-LAMP最低检测限为10－5稀释度，与新城疫rRT-PCR检测灵敏度相当（图3）。将pMD○R18-T-F重组质粒从105μL开始进行10倍稀释，进行NDV-rRT-LAMP检测，结果显示该法最低检测限在101～102，计算约为50个基因拷贝。

图3 热裂解法NDV-rRT-LAMP灵敏度试验结果Fig.3 Sensitivity test results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.3.2 NDV-rRT-LAMP特异性试验结果 NDV-rRT-LAMP特异性试验表明，所建立的方法无论进行实时荧光RT-LAMP检测，还是加入染料后进行肉眼观察，均与 AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病原体无交叉反应，表明所建立的方法特异性强。

2.4 田间样品检测结果

20份田间样品同时进行NDV-rRT-LAMP和实时荧光RT-PCR检测，结果显示两种检方法均特异性检测出NDV阳性4份，阴性16份，检测结果完全一致。

3 讨论

LAMP方法自2001年发明以来，引发了广大科研人员的关注，有关LAMP检测技术的应用也十分广泛［2－14］。LAMP在非洲受到了广泛关注，被制定成标准方法用于人的非洲锥虫病的诊断。世界动物卫生组织（OIE）也对禽流感病毒RT-LAMP技术进行了评价，认为该方法简便实用，同时也指出该法存在漏检现象。

在LAMP的引物设计中，目前多采用设计环引物来提升检测速度。在本研究中，如果再加入2个环引物，则需要找到8个相对保守的区域，非常困难。所以在找到6个相对保守的区域情况下，没有设计环引物而直接进行检测。发现尽管不采用环引物，仍然在1h内可以得到检测结果，检测速度仍然快于实时荧光定量RT-PCR技术。

LAMP传统结果判定方法有两种，一种是通过在终反应液中加入核酸染料，观察荧光及颜色变化并结合凝胶电泳判断检测结果；另一种是通过实时监控反应液中白色焦磷酸镁浊度而进行实时检测。但采用一种小型便携式仪器，将实时与肉眼观察结合起来，以便在现场或基层进行快速分子生物学检测，是LAMP进一步推广使用的制约条件。我们通过反应前在RT-LAMP反应体系中加入荧光染色剂Calcein，在管盖内侧滴加SYBR GreenⅠ，使用ESEQuant Tube Scanner仪进行实时扩增曲线，反应后倒置混匀进行肉眼观察，实现了实时荧光和肉眼观察的同时检测。由于SYBR GreenⅠ具有核酸扩增的抑制性，所以在反应前不能将其混入反应液，而需要滴加于管盖内侧靠边的位置。LAMP由于扩增效率极高，打开盖后会出现气溶胶污染，所以反应结束后严禁打开管盖。我们曾尝试在实时荧光RTLAMP检测前，在反应液表面滴加石蜡油来防止打开盖时的气溶胶污染。但发现石蜡油对ESEQuant Tube Scanner仪的实时检测有影响，荧光信号非常低，且不稳定。

本试验针对NDV的F基因中高保守且特异性强核苷酸序列设计引物，通过采用简并引物来避免漏检，可用于NDV基层的分子生物学快速检测。同时本试验成功将热裂解法［15］与 NDV-rRT-LAMP结合，大幅度缩短了待检样品处理时间。

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Establishment of Real-time Fluorescent Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification for Newcastle Disease Virus Detection

CHEN Bing1，HU Yun-fa1，SUN Jie2，CHEN Shu-kun2，LIU Jian-li2，ZENG Shao-ling2，CAO Chen-fu2，ZHANG Cai-hong2，RUAN Zhou-xi2，LIN Qing－yan1，LÜJian-qiang2，YANG Jun-xing2，HUA Qun-yi2，LU Ti-kang1，QIN Zhi-feng1

（1.ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Shenzhen，Guangdong，518045，China；2.ShenzhenInspectionandQuarantineScienceResearchInstitute，Shenzhen，Guangdong，518001，China）

Newcastle disease virus（NDV）is a major causative agent and a rapid and sensitive molecular biological diagnosis is crucial to prevent and control Newcastle disease.NDV real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（NDV-rRT-LAMP）was established by means of heat treatment of the samples.The sensitivity，specificity and repeatability of this method were evaluated.The results showed the sensitivity of this method was equal to the NDV real-time RT-PCR assay，and the detection limit was fifty gene copy per reaction.This method had no cross-reactivity with other avian disease agents such as AIV，IBV et al.Small-scale tests for field samples indicated this method was reliable for survey monitoring of N5on site.

Newcastle disease virus；real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification；detection on site

S852.659.5；Q789

A

1007-5038（2014）07-0011-04

2013-12-17

科技部质检公益项目（201210018-4）；深圳市基础研究重点项目（JC201105190875A）

陈 兵（1981－），男，河南人，硕士研究生，主要从事进出境动物检疫研究。＊通讯作者