一株猪源大肠埃希菌O119：K69的分离鉴定及药敏试验

邓 波，齐新永，葛 杰，沈莉萍，张维谊，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

一株猪源大肠埃希菌O119：K69的分离鉴定及药敏试验

邓 波，齐新永，葛 杰，沈莉萍，张维谊，周锦萍＊

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

为了解某腹泻猪群发病原因并进行对症治疗，对该猪群1头病死猪进行病理剖检，无菌采集心、肝、脾、肺、胆汁和结肠黏膜进行病原学检测，通过对结肠黏膜中分离的1株细菌进行鉴别培养、VITEK鉴定和血清型诊断，鉴定出该细菌为大肠埃希菌O119：K69，并通过16种药物的药敏试验，发现该细菌仅对阿米卡星敏感，其他药物均耐药。根据药敏试验结果，结合补充电解多维、更换饲料和消毒等综合措施对该猪群进行治疗，病情逐渐好转。

大肠埃希菌O119∶K69；分离鉴定；药敏试验

近年来，大肠杆菌病日益成为制约养猪业发展的重要细菌性疾病，但由于大肠埃希菌复杂的血清型及全国各地区存在的大肠埃希菌耐药性的差异，导致其防治越来越困难［1］。李迎晓等［2］从河南省分离到4株大肠埃希菌O8、O157、O117、O38对小鼠有较强的致死性，为致病性大肠埃希菌。在德国及一 些 欧 洲 国 家［3－4］，产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 菌O114∶H7和肠出血性大肠埃希菌O104∶H4等疫情造成数千人感染，至少数十人死亡，这次疫情对整个欧洲都造成了一定的影响［3］。

抗菌药在治疗临床疾病、维持动物健康和生产中起到了重要作用，但抗菌药物使用得越多耐药性亦变得越严重［6］。抗生素不但能引起接受治疗的个体或群体体内病原菌产生耐药性，而且能引起整个内源菌群产生耐药［7］。马全朝等［8］研究了从上海市猪场分离到的致病大肠埃希菌对氨苄西林、四环素、利福平、甲氧苄啶、卡那霉素的耐药性，结果表明耐药率为80%～90%，菌株对7种～15种抗菌药有耐药性。李刚等［9］对青海地区18株致病性大肠埃希菌进行的药物敏感试验结果表明，18株菌株对20种药物均有不同程度的耐药性，多重耐药普遍存在，青霉素完全没有抑菌作用。目前，磺胺类药物对大肠杆菌病也不能起到很好的治疗效果［10］，抗菌药物使用频度与细菌耐药性呈正相关［11］。本研究通过对某发病病死猪的病理剖检、细菌分离鉴定及药敏试验，为指导临床用药及分析耐药性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源及背景 11月上旬，上海市宝山某农户送检3月龄育肥肉猪1头，该批猪存栏450头，均为2月龄时从江苏购回，病程1周左右，发病200头，死亡80头，主要症状为拉稀，呈黑色，无其他明显临床症状。该批猪购回后未免疫任何疫苗，发病后口服支原净和土霉素，注射泰乐菌素和环丙沙星。经剖检，肺轻度实变，脾脏背面出血、边缘有锯齿状梗死、胃底黏膜严重出血、肠壁增厚、回肠水肿。

无菌采集该病死猪心、肝、脾、肺、胆汁和结肠黏膜进行细菌分离。

1.1.2 培养基 Columbia 血琼脂 （批号1219005），为Oxoid公司产品；羊血（批号131001），为宝络生物公司产品；康凯琼脂（批号130327），伊红美蓝琼脂（批号130703），三糖铁琼脂（批号130619），SS 琼脂（批号110812），MH 肉汤（批号120330），为北京陆桥技术有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 革兰阴性菌鉴定卡（GNI＋），批号为S109M，由法国梅里埃公司提供；肠道致病性大肠埃希菌诊断血清（批号20130101），肠道侵袭性大肠埃希菌诊断血清（批号20130501），肠道产毒性大肠埃希菌诊断血清（批号20130501）为宁波天润生物药业有限公司产品；大肠埃希菌（ATCC25922、ATCC35218）为中国兽药监察所产品；药敏纸片（批号120614）为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养 将无菌采集的病料心、肝、脾、肺、胆汁和结肠黏膜分别接种血琼脂板，在体积分数为5%CO2培养箱中经36℃培养24h，挑取可疑菌落涂片镜检并纯培养。将纯培养物分别接种于麦康凯、伊红美蓝、巧克力琼脂、SS琼脂等培养基，观察其培养特性。

1.2.2 VITEK鉴定 对分离的细菌纯培养物按照细菌鉴定卡操作规程进行操作，并在VITEK-32全自动细菌鉴定仪上读取细菌鉴定结果。

1.2.3 大肠埃希菌血清型诊断 于洁净玻片上滴1滴诊断血清，然后取被检菌少许与血清混匀，轻轻摇动玻片，试验应以生理盐水溶液做对照。1min内呈明显凝集，＋＋＋以上者判为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。

通过大肠埃希菌纯培养物先与OK多价血清做玻片凝集试验，阳性时，再以所属的OK单价血清于原处取培养物做凝集试验，以确定菌群。如与某个单价血清凝集，再以该血清与3个以上菌落做凝集试验，阳性时，选强凝集的菌落移种到三糖铁培养基上，经37℃培养18h后，观察结果，并制成浓厚菌液，于100℃水浴中加热30min，再与相应的OK单价血清或O单价血清做玻片凝集试验，如仍为阳性，则可与其生化特性综合做出诊断。

1.2.4 药敏试验 将细菌纯培养物菌落浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管，接种MH琼脂平板，采用纸片法进行体外药敏试验，35℃培养18h观察结果。试验方法及判读标准参照NCCLS 2010标准。

2 结果

2.1 培养特性

从结肠黏膜中分离到圆形凸起、光滑、湿润、半透明的灰白色菌落，直径约2.4mm，在Columbia羊血平板上呈β溶血；经革兰染色为阴性短杆菌；在麦康凯琼脂上形成中等大小、圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐的亮红色小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成带有金属光泽的黑色菌落；在巧克力琼脂培养基上生长形成中等大小、圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐的白色菌落；在SS琼脂培养基上未见生长；在三糖铁琼脂斜面和穿刺部分变黄、产生气泡。

2.2 分离菌株生化特性鉴定

根据培养特性，选择革兰阴性菌鉴定卡（GNI＋）。分离菌在VITEK-32全自动细菌鉴定仪上鉴定结果为大肠埃希菌（Escherichiacoli），生化特性详见表1。

2.3 大肠埃希菌血清学诊断

根据VITEK结果，选择大肠埃希菌血清学诊断试剂对分离菌进行凝集试验，结果为大肠埃希菌O119：K69。

2.4 药敏试验

分离的大肠埃希菌O119：K69对阿米卡星敏感，抑菌圈为20mm，无中介，其他15种药物均表现耐药，详见表2。

表1 分离菌生化试验结果Table 1 Results of biochemical test of bacterial strain

表2 分离株药敏试验结果Table 2 Results of drug susceptibility tests for bacterial strain

3 讨论

根据主诉，样品来源猪群为保育猪，且发病率和病死率分别为44.4%和40%，通常情况下保育猪单纯大肠埃希菌感染没有这么高的致死率，本试验又对样品中流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和猪增生性肠炎进行了检测，3种病毒的PCR检测结果均为阴性，猪增生性肠炎检测结果为阳性，故怀疑猪群存在混合感染。但胞内劳森菌目前有待进一步分离鉴定。

孙广力等［12］于2004年在仔猪病料中分离到77株8种抗O型血清型大肠埃希菌，其中7种接种小鼠后导致小鼠发病和致死。根据宁波天润生物药业有限公司提供的大肠埃希菌诊断血清的分类，大肠埃希菌O119：K69属于肠道致病性大肠埃希菌，下一步准备对本试验的分离菌开展小鼠致病性试验以对其致病性进行确认。

据相关报道，细菌的药敏试验及联合药敏试验与临诊疗效的符合率可达到80%左右，因此对细菌进行分离鉴定和药敏试验从而根据该细菌的特性和药敏的结果，选用合适的抗菌药和治疗措施，对于细菌学疾病的诊断具有重要意义。通常情况下大肠埃希菌感染应选择氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗生素；在考虑药物的动力学、药效学特征的基础上，结合畜禽的病情、体况制定合理的给药方案；防止药物的不良反应和残留；合理联合用药，根据抗菌药的作用特性和机理进行选择和组合，防止盲目联合；避免耐药性的产生。

我国很多地区的兽医从业者没有经过专门培训，没有执行或缺少抗菌药的使用规范，抗生素的不合理使用甚至是滥用的现象十分严重，根据近年来本实验室对大肠埃希菌16种常用抗生素的耐药性监测结果表明，大肠埃希菌多存在10到11重耐药，故临诊治疗时应根据正确的诊断选择合适的物采取综合措施，对症治疗，尽量减少使用或不适用抗生素。

根据药敏试验结果，畜主对猪群肌肉注射硫酸阿米卡星、电解多维饮水、环境消毒、减少饲喂和更换全价饲料等综合措施，猪群发病情况明显好转，1周后无突然死亡病例，2周左右后基本无拉稀发生。

致病性大肠埃希菌主要存在于母猪的肠道、产道及周围环境中，通过消化道感染，带菌母猪是本病的主要传染源。据相关文献记载，猪大肠杆菌病的发生没有明显的季节性，季节交替、极寒炎热、气候多变、天气湿冷等情况下易出现该病，消毒不彻底、饲养管理不规范、卫生条件不合格、饲料骤变等应激因素可促使本病发生。该病的流行病学特点可以为其防治提供理论参考依据。

使用1g／L的高锰酸钾水溶液对发病猪皮肤、黏膜及母猪产床进行消毒；严格按照标准供给母猪全价饲料，仔猪断奶前后合理控制饲料的供给；加强仔猪的饲养管理；做好防寒避暑；根据猪群生长发育特点及时补充铁、硒等微量元素以增强机体的抗病能力，为该病起到一定的预防作用。

［1］戴秀美，常维山.2012年我国部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析［J］.畜禽业，2013（285）：50-52.

［2］李迎晓，焦凤超，易本驰，等.猪源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.江苏农业科学，2013（41）：217-218.

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［6］van den Bogaard A E，London N，Driessen C，Stobberingh E E.Antibiotic resistance of faecalEscherichiacoliin poultry，poiltry farmers and poultry slaughterers［J］.J Antimicrobial Chemotherapy，2001，47：763-771.

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［10］刘开成，郑增忍，单 虎，等.不同地区猪源大肠埃希菌磺胺类药物耐药性研究［J］.动物医学进展，2011，32（4）：76-79.

［11］孙广力，孙刚，李书华，等.黑龙江省规模化养猪场大肠杆菌病血清型流行病学调查［J］.黑龙江畜牧兽医，2004（7）：90-91.

Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of OneEscherichiacoliO119：K69in Swine

DENG Bo，QI Xin-yong，GE Jie，SHEN Li-ping，ZHANG Wei-yi，ZHOU Jin-ping

（ShanghaiCenterofAnimalDiseaseControl，Shanghai，201103，China）

In order to determine the pathogen of diarrheic herd and provide correct treatment，one dead pig was examined pathologically.The heart，liver，spleen，lung，bile and colon mucosa were collected and detected.Based on the differential culture，VITEK identification and serological diagnosis，a strain ofEscherichiacoliO119：K69was identified.Through the sensitivity test of sixteen kinds of drugs，the bacterial strain was only sensitive to amikacin，and other drugs were all resistant.According to the results of drug sensitivity test，the comprehensive measures combined improving dehydration，replacing feed and disinfection treatment of the herd make the herd recovered gradually.

EscherichiacoliO119：K69；differential culture；drug sensitivity test

S852.612；S858.28

B

1007-5038（2014）07-0121-04

2013-12-11

邓 波（1982－），湖北人，男，兽医师，硕士，主要从事重大动物疫病及人畜共患病检测工作。＊通讯作者