一氧化氮在结核分支杆菌感染巨噬细胞中的作用研究进展

何玉龙，张文清，吴月红

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021）

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的人兽共患慢性传染病，全世界约有1/3的人感染MTB。据世界卫生组织（WTO）2012年估算，全世界共有860万人罹患结核病，130万人死于结核病。我国是结核病高发国家之一，其中肺结核病人总数居全球第2位，是全球22个肺结核高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药肺结核流行严重的国家之一［1］。因此，结核病不仅是我国重点控制的三大重大疾病之一，也是全球关注和亟待解决的重要公共卫生问题和社会问题。

巨噬细胞是固有免疫应答中最主要的细胞类型，在宿主防御细菌性病原体中发挥着关键的作用。一氧化氮（nitric oxide，NO）在肺响应感染和抑菌及杀菌的宿主防御过程中起重要作用［2］。其中巨噬细胞产生的 NO可以起到抑制微生物的作用［3］。MTB为典型的胞内寄生菌，侵染机体后主要被体内的巨噬细胞所吞噬，未被机体免疫系统清除而潜伏下来的MTB也主要寄生于巨噬细胞内。MTB与其宿主巨噬细胞的相互作用对结核病的病理发生和发展起着重要的作用，许多细胞内外的信号分子已被证实参与了这一病原-宿主的相互作用过程。巨噬细胞可通过氧化杀菌机制产生NO等氧自由基杀死寄生于其内的 MTB，来阻止 MTB在体内的扩散，并能激活邻近未感染的巨噬细胞，增强机体对MTB的杀伤能力［4］。研究表明，牛巨噬细胞产生的NO是抵御MTB感染的主要因素，而并不是巨噬细胞的凋亡［5］。因此，巨噬细胞产生NO的能力对于寄生于其中的MTB的命运至关重要。

鉴于NO在宿主防御过程中的重要作用，本文就NO在MTB感染宿主巨噬细胞过程中的作用进行综述，以期为结核病的防控提供理论依据。

1 NO的产生和功能

NO是近年来发现的倍受关注的气体性无机小分子，它参与人体多种生理和病理过程，是细胞间信息传递的重要调节因子。NO具有各种各样的作用，取决于其相对浓度以及生成的环境。尤其在免疫应答中NO发挥了多种功能，包括控制感染，以及参与调控信号级联反应、转录因子、血管反应、白细胞滚动、迁移、细胞因子生成和T细胞分化［6-7］。而且巨噬细胞产生的NO对所吞噬的肿瘤细胞和微生物等具有直接的细胞毒性作用［8］。在激活的巨噬细胞内，通过诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）催化生成NO。生成的NO与·O2-结合后进一步氧化成·NO2-和·NO3-。NO、·NO2-和·NO3-等共同构成具有杀菌活性的活性氮中介物（reactive nitrogen intermediate，RNI）。NO和RNI可以对抗或杀死包括MTB在内的多种入侵的病原体［9］，是对抗病原体的一个最有效的分子杀菌方式。因此，NO被认为是宿主防御的基本介质。

体内在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）或四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin）存在条件下，一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）催化L-精氨酸与氧分子反应，生成 L-胍氨酸和 NO［10］。iNOS在许多种细胞因子、LPS和微生物诱导时均能产生大量的NO。产生的NO作用于微生物的关键代谢酶，使其失活而发挥抗微生物的作用［11］。活性iNOS诱导产生的低浓度NO（在μmol/L范围内），具有抗菌、抗动脉粥样硬化或凋亡作用［12］。但过高浓度的NO也会加重炎症反应，导致组织损伤［13］。因此，在炎症反应过程中，必须有严格机制控制iNOS的表达，从而保持适当浓度的NO产生。

2 NO在抵御MTB感染中的作用研究

小鼠中NO不仅在抵抗MTB的防御反应中起重要作用，通过使用L-单甲基-精氨酸（L-NG-monomethyl-arginine，L-NMMA）等NOS抑制剂或iNOS基因敲除小鼠研究证明，NO在百日咳鲍特菌［14］、伤寒沙门菌［15］及柯萨奇病毒、人类疱疹病毒和单纯性疱疹病毒（HSV-1）［16］等感染中表现出抗菌或抗病毒活性。另外，经细胞因子或LPS刺激巨噬细胞大量表达iNOS后产生的NO对球虫、弓形虫、锥虫、疟原虫、肝片吸虫、血吸虫等寄生虫也有杀伤作用［17］。NO除直接杀伤入侵的 MTB等病原微生物外，其介导的细胞凋亡是激活的巨噬细胞对抗MTB的另一种防御机制［18］。

2.1 在小鼠上的研究

MTB感染小鼠宿主巨噬细胞后，通过iNOS产生的NO可以有效杀灭或抑制包括有毒株（Erdman）在内的MTB的生长。感染MTB后的小鼠使用氨基胍和L-NMMA两个不同的iNOS抑制剂后发现，在小鼠死亡率、细菌负担、病理组织损伤等方面呈现出类似的毒害效应，说明NO在对抗MTB中有重要的作用［19］。此外，NO还能通过抑制呼吸作用诱导MTB的休眠程序［20］。用实验室和临床分离株两种不同来源的MTB感染iNOS（即NOS2）缺失的小鼠（NOS2-/-）后，发现 NOS2-/-的小鼠更易感染 MTB［21］。Olin M R等［22］利用iNOS基因敲除的小鼠（iNOS-/-）研究了NO在中枢神经系统抵御MTB感染中的作用，发现MTB感染iNOS缺失（iNOS-/-）的小鼠，出现严重的临床表现和肉芽肿病变（包括MTB遍布整个脑膜），类似于人体结核性脑膜炎表现。但这些病理表现在MTB感染的野生型小鼠中未出现，据此进一步证实NO在中枢神经系统抵御MTB中也起重要的作用。

2.2 在人体的研究

NO是否在人类宿主防御MTB过程中也起关键作用尚存争议。尽管证实人类肺泡巨噬细胞早期抑制MTB生长不依赖于NO的抗菌机制，但这并不能排除NO在人的宿主防御机制中的作用［16］。越来越多的证据表明包括卡介苗（BCG）在内的MTB感染人类单核细胞/巨噬细胞、肺泡巨噬细胞系和上皮细胞内均能引起iNOS的表达，并催化产生NO对抗或杀死 MTB［9］。包括L-NMMA在内的4种不同的iNOS酶抑制剂可以抑制MTB诱导的NO产生，抑制NO产生后造成2个临床分离株MTB在细胞内生长的增加。而利用供体（S-亚硝基-N-乙酰青霉胺）释放的NO对肉汤培养基中相同菌株也有直接抑制作用。菌落检测和使用LNMMA也证明弱毒株BCG诱导产生的NO及其与氧自由基反应的产物过氧亚硝酸盐在杀灭人肺泡巨噬细胞中BCG发挥重要作用［16］。

近年来在人体的研究也证明NO对结核病的发生及发展有重要的调控作用。与健康对照组相比结核病患者呼出气体中的NO浓度和尿中NO代谢物浓度较低［23］。Ralph A P等［24］研究发现，与88名对照者相比，200名肺结核患者的呼吸气NO（Fractional exhaled NO，FENO）在肺结核确诊的时候水平较低，在治疗初始时更低（1周时最低），而在治疗6个月后恢复。说明NO在人类结核病发病过程中有重要的作用，并提示呼吸气NO的降低不利于结核病的治疗，即增加肺NO的水平对结核病的治疗有辅助作用［24-25］。

3 NO与细胞因子的相互作用

多种细胞因子均可调节NO的合成，如LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6 和 MIF 都 可 诱 导iNOS表达并产生NO；而另外一些细胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10 等则抑制 NO 的生成［26-28］。有报告显示，与健康对照相比结核病患者肺泡巨噬细胞中NO生成的增加对TNF-α和IL-1β炎性细胞因子合成起调节作用［12，29］。推测可能的机制是产生的NO促进TNF-α和IL-1β的分泌，随后又通过反馈回路影响NO产生［12］。此外，NO调节活动性结核病患者外周血单核细胞释放 TNF-α，反之亦然［29］。MTB感染后会通过NLRP3炎性体引起有害促炎细胞因子IL-1的产生，但NO能通过硫醇亚硝基化作用特异性抑制NLRP3炎性体的组装，从而抑制NLRP3炎性体依赖的IL-1加工过程控制结核病［30］。

4 结语

结核病是一种古老的疾病，自20世纪90年代，由于多重耐药结核菌（MDR-TB）的流行、人类免疫缺陷病毒（HIV）的感染及贫穷等多种因素的影响，全球结核病发病率呈日益回升的趋势。MTB致病、耐药机制及机体对MTB的免疫清除机制的研究，为研制新型诊断试剂、抗结核药物和结核病新疫苗等工作奠定基础。

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