载体红细胞在抗肿瘤治疗中应用的进展

席芸，钱晓萍，刘宝瑞

(1. 东南大学医学院，江苏 南京 210009； 2. 南京大学医学院附属鼓楼医院 肿瘤科，江苏 南京 210008)

抗肿瘤药物细胞毒杀伤作用无选择性，且在体内环境中难以保持稳定的有效浓度。将抗肿瘤药物通过载体靶向运送至肿瘤组织后再释放是降低药物毒副作用、减少用药剂量、增强药物在局部药效的最佳办法。科学家们尝试过多种方法提取或仿生合成红细胞膜用于载药系统，但面临生物相容性、生物安全性等问题，于是采用红细胞直接作为载体的想法应运而生[1]。自体血液中分离的红细胞具有类似脂质体作为药物载体的潜能，不同载药方式处理和修饰后建立起来的载体红细胞有较好的安全性、有效性和易耐受性。此外，红细胞经修饰后可具有不同的靶向性，应用于抗肿瘤药物的运输可以提高其肿瘤局部治疗的效果。

1 红细胞作为药物载体的优势

红细胞除了运送氧气、二氧化碳之外还有抗原识别能力，能调节体内多种免疫杀伤细胞的活性，同时能识别、黏附和提呈肿瘤抗原。其作为一种药物载体除了有提高治疗效果、减小毒副作用[2]外，还具有以下一些独特的优越性[3- 4]。

1.1 易获得和体内循环生存时间长

正常人体血液中的红细胞数量多达(3.5～5)×1012L-1，占所有血细胞的99 %以上。而且载体红细胞空载时在体内循环中的寿命平均为89～131d，半衰期为19～29d，接近于正常红细胞的值。因此，血液学指标较好的肿瘤患者可以利用自身的红细胞作为药物载体而不影响其健康状况。同时对红细胞或药物进行修饰，通过一些化学键或静电作用改变药物与红细胞的连接方式，还可以使药物释放达到理想的速率[5]。

1.2 可观的表面积、体积和生物靶向性

红细胞膜面积约为160μm2，体积约为90μm3，为载体修饰和药物包载提供了大量的位置和空间[6]。衰老、变性的红细胞主要在机体网状内皮系统内被清除，这虽然可以被设计成脾、肝靶向的药物载体，但并不能发挥红细胞作为生物载体长循环的优势，但是通过对红细胞的修饰可使载体红细胞将药物选择性地定向于靶部位[7]。

1.3 安全性和耐受性

与其他药物载体相比，红细胞作为机体自身的组成部分具有其他人工合成的药物载体无法比拟的生物相容性和生物可降解性，应用患者自身的红细胞还可以避免免疫系统的干扰。红细胞膜为半透膜，对载入药物的缓慢释放可以使药物在循环中维持稳定的有效浓度，可以减少用药量和给药次数，同时安全性、耐受性也能显著提高。

2 载药方式

目前已研究出多种包载药物的方法，主要分为细胞内包埋和细胞表面吸附两种途径，将包有药物的微球吸附于红细胞表面是最近提出的载药方式。

2.1 细胞内包埋

当红细胞外渗透压为150mOsm·kg-1H2O(即溶血临界点)时，红细胞可逆性膨胀至原体积的125%，呈椭圆形，红细胞膜上孔隙(D=20～50nm) 短暂开放，外界物质即可进入红细胞，同时红细胞内的血红蛋白部分逸出红细胞；当红细胞外渗透压恢复至300mOsm·kg-1H2O时，红细胞可以恢复原状，膜上孔隙随之关闭，外界物质即包封于红细胞内[7]。

2.2 表面吸附及修饰

红细胞膜表面为载药提供了大量的链接位置和空间，目前常用的结合方式有化学键结合(共价键或非共价键)、药物作为配体与载体红细胞上修饰的受体结合、在药物上连接抗体结构与载体红细胞表面固有的抗原结合[8]。表面吸附可以减少对载体红细胞的损伤及生物相容性的影响，前药的应用可以避免血浆中抑制因子对药物的灭活。

2.3 载微球红细胞

微球是最近发展起来的新型药物载体，微球的控释效果好但循环清除率高，而红细胞载体易获得、在循环中生存时间长，但控释效果差，这样两者正好进行互补，使得载微球红细胞在理论上有循环时间长、药物释放稳定、药物清除后对红细胞无影响的优点。

Elizabeth等[9]证实，直径在100nm～1.1μm的微球可以吸附在红细胞表面，并且不影响红细胞的形态，且在24h内较稳定。体内实验证实，微球吸附于红细胞表面后体内循环时间从2h延长到12h，并且在微球被完全清除后被其黏附的红细胞在体内的循环并没有受到影响。吸附和脱落方式研究结果显示：(1) 血清中的调理素、补体等物质会影响微球与红细胞的连接；(2) 连接方式(疏水键/共价键/静电作用) 不同、直径不同，导致体内循环时间不同；(3) 脾脏主要作用于大颗粒，使微球从红细胞上脱落，而肝脏主要作用于小颗粒，清除体内的微球；(4) 细胞间相互作用、毛细血管壁的作用和血管内剪切力是微球从红细胞上脱落的主要作用因素，其中细胞间的相互作用最大。后续的体内实验证实，用聚乙二醇修饰载微球红细胞能进一步降低微球的清除率，循环中微球被完全清除所需的时间从2d延长到7d以上。

最近，Fan 等[10]成功地将低分子壳聚糖微球吸附于载体红细胞表面，并且对红细胞的功能及寿命没有产生明显的影响，为红细胞- 低分子壳聚糖复合物成为血管内药物运输系统奠定了基础。

3 红细胞的修饰与保护

为了增强载体红细胞与药物连接的稳定性、控制药物释放、改善靶向性，对载体红细胞进行修饰也是目前研究的热点。

3.1 戊二醛

Marczak[8]经一系列的实验后认为用戊二醛修饰载体红细胞可以达到以下目的：(1) 增加药物稳定性；(2) 增强载药红细胞体内、体外的活性；(3) 使载药红细胞不被巨噬细胞“吞噬”；(4) 使包载的药物与包膜连接，在连接键水解后药物经包膜缓释，但戊二醛会影响载体红细胞功能并使载体红细胞寿命缩短而使其应用受阻。

3.2 DTSP/BS3

DTSP[3，3′- 二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)]和BS3(双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐) 都是一种Band 3(带3蛋白) 交联试剂。用Band 3交联试剂修饰的载体红细胞更易被巨噬细胞识别和吞噬(吞噬率从3 %提高到了11 %)，并且经Band 3与巨噬细胞形成牢固连接[7]，但其生物安全性和生物相容性需要进一步认证。

3.3 磁化

磁化载体红细胞是将有磁性的纳米颗粒包埋入载体红细胞或者吸附在载体红细胞表面，再利用体外磁场作用引导，提高靶部位药物浓度，降低抗肿瘤药物对正常组织的毒副作用[11]。

3.4 免疫逃避保护

药物长期与红细胞接触会使红细胞生理结构发生改变，易过早地被内皮网状系统识别，进而被吞噬细胞清除[11]。徐艳艳等[12]证实用海藻酸钠- 聚赖氨酸- 海藻酸钠微囊包裹红细胞可保护其免受宿主免疫系统的排斥，且该囊膜具有一定的通透性，氧气、葡萄糖等小分子物质能透过囊膜。用该囊膜包裹载药的红细胞可以在保证药物稳定释放的同时发挥红细胞作为生物载体长循环的优势，或许还能保护异体红细胞载体逃避体内免疫系统的排斥。

4 载体红细胞在抗肿瘤药物运输方向的应用

目前能被载体红细胞包载的物质有50多种，其中载L- 门冬酰胺酶红细胞已经应用于临床治疗急性淋巴细胞白血病[5]；部分细胞抑制剂、抗生素、激素、维生素、酶类和疫苗已经成功地被载体红细胞包载[2- 3，13]。

4.1 依托泊苷

Lotero等[7]建立了载依托泊苷(etoposide) 红细胞，并进行了体内实验。用低渗透析等渗重封的方法包载，最大包载率为22%，细胞回收率为56.6 %。用BS3处理载体红细胞能使巨噬细胞对载依托泊苷红细胞的吞噬量从4 %提高到14 %，载依托泊苷红细胞能使巨噬细胞内(15.36±4.67)%的DNA骨架断裂，而依托泊苷裸药只能使巨噬细胞内(9.0±2.65)%的DNA骨架断裂，说明经红细胞包载后依托泊苷对巨噬细胞的毒性增强。

4.2 5- Aza- 2- dC

Caterina等[14]用病毒刺突融合糖蛋白修饰载体红细胞包载5- Aza- 2- dC(5- 杂氮- 2′- 脱氧胞苷)，并用荧光染色观察其作用于人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)的过程：(1) 30min后载药红细胞开始与HeLa细胞连接；(2) 6h后大部分载药红细胞进入HeLa细胞的胞浆内；(3) 12h后载药红细胞的膜开始与HeLa细胞的膜黏附，药物释放入肿瘤细胞内；(4) 96h后大部分HeLa细胞出现了细胞凋亡晚期的典型微核形态。该实验还证实，用HA病毒蛋白修饰载体红细胞能通过与HeLa细胞的高效黏附增强药物的生物利用度。

4.3 甲氨蝶呤

袁盛华等[15]对载体红细胞包载甲氨蝶呤做了一系列的临床前试验。首先，用正交试验确定了高渗法制备的最佳条件值，使载药率提高到了41.58 %，并且证实该方法不改变载体红细胞的免疫黏附性。接下来的体内研究证实，甲氨蝶呤经载体红细胞包载后血药浓度高峰从(13.6±3.7)mg·L-1下降到(2.7±1.2)mg·L-1，半衰期从(3.9±0.8)h延长到(13.5 ± 2.0)h，说明载体红细胞对甲氨蝶呤有缓释效应；在产生与裸药相近的抑瘤作用的同时将荷瘤小鼠的8d存活率从50 %提高到87.5 %，而且对丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、血清肌酸酐等生化指标的异常有明显逆转作用。彭丽华[16]也证实载甲氨蝶呤红细胞相较于甲氨蝶呤裸药能提高大鼠的生存能力，还能保护大鼠的肝肾功能。

4.4 长春新碱

施莹等[17]对载体红细胞包载长春新碱做了一系列临床前研究。用改良低渗预膨胀法制得了稳定的对载体红细胞天然免疫活性无影响的载长春新碱红细胞，平均载药率高达(61.42±3.69) %，细胞平均回收率高达(90.61±4.95) %，高倍镜下观察载体红细胞形态，比较包载前后均无明显变化。体内实验证实，长春新碱载药红细胞组对小鼠移植瘤的抑制率为42.42 %，是单用长春新碱组的2.43倍，而且长春新碱载药红细胞组小鼠的体重增加也较单用长春新碱组更明显，说明长春新碱经载体红细胞包载后不仅抗肿瘤效应增强，还减少了毒副作用；连续检测小鼠血液、肿瘤、肝脏内的药物浓度可以发现经红细胞包载后长春新碱在血中的半衰期达4.1h，是单用长春新碱组的2.68倍，并且静脉输注后72h内长春新碱载药红细胞组在肝脏、肿瘤内长春新碱的浓度高于单用长春新碱组，说明载体红细胞对包载的长春新碱有缓释作用，并且有肝脏、肿瘤靶向性。

5 结 语

用完整的细胞作为运输载体的思路在载药系统建立的研究中已产生多年[18]，且越来越多地被关注和研究，其中将患者自身的红细胞作为药物载体来减少化疗药物的毒副作用、延长药物的作用时间、增强药物的肿瘤局部作用效果是一种既简单又安全的途径。相较于纳米载体，技术方法较易普及，且有更好的生物相容性和生物可降解性。但是肿瘤患者自身的红细胞通常有某些结构和分子的改变影响其药物运输的功能[19]，海藻酸钠- 聚赖氨酸- 海藻酸钠微囊等技术使载体红细胞的建立不局限于自身的红细胞，使得该技术能被更广泛地应用。对红细胞载药研究至今，科学家们虽然有很多重大的突破，同时也面临着许多难题。如何能更好地控制载体红细胞对所载药物的释放；通过各种修饰提高载体红细胞的靶向性，增加载体红细胞的靶向部位；使载药过程和对载体红细胞的修饰过程不影响载体红细胞的结构、功能和生物相容性等这些问题都是值得我们去进一步探索的。对载药红细胞的研究大都只停留于临床前的研究，只有少数几种药物进入了临床应用，这其中缺乏资金支持、缺乏统一的标准认证等都是亟待解决的问题。接下来对红细胞载药的研究应更多地着重于向临床的推广，确定红细胞载药系统统一的安全性检测标准；同时增加载体红细胞的载药种类，增强载体红细胞的靶向性等都是科学家们接下来要努力的方向。

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