BMSCs在骨关节外科领域中的研究进展

孙鹏浩,王宸,常青

(东南大学附属中大医院，江苏 南京 210009)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal-stem cells，BMSCs)是干细胞的一种，存在于骨髓中，它的存在是1976年由Friedenstein等[1]首次提出的。因为其在体外培养过程中容易贴壁并形成纤维样的克隆，因此也被称为成纤维细胞集落形成单位。多数的BMSCs在体内处于休眠状态，只有当受到一定刺激因素作用时才进入细胞周期，增殖并分化成骨或软骨组织等之类的细胞集落。

1 BMSCs的分离培养

目前，体外分离培养BMSCs较为常用的方法有：(1) 全骨髓培养法：因BMSCs体外培养时有贴壁生长的特性，故在无菌获得的骨髓中加入培养基制成细胞悬液，将细胞悬液直接置于培养瓶中培养，原代培养时培养物中造血细胞占大多数。该方法的优点在于操作简单、细胞活性好，但所得细胞的杂质细胞较多，纯度不高[2- 3]；(2) 离心培养法：利用骨髓中各种细胞比重的不同，使用梯度离心法分离并提取BMSCsS后进行培养。在骨髓中加入淋巴细胞分离液稀释混匀后，以1 500～2 000 r·min-1的速度离心20～30 min，取交界处的单核细胞层，再用PBS冲洗2～3次，加入培养基中接种培养即可。这种方法优点为所获得细胞纯度较高，但因为淋巴细胞分离液有一定的细胞毒性，且整个过程中进行了数次的离心，故而使细胞的活力降低[2,4]；(3) 细胞表面分子标记分选法：利用BMSCs的细胞表面标记物进行分离,这种方法一般利用流式细胞仪、免疫磁珠或者免疫沉积法。尽管通过此方法获得的细胞纯度很高，但由于如今研究仍未找到特异性的BMSCs表面标记物，而且该方法步骤较多、过程长、成本较高、分选效率低，且对细胞活性有明显影响，故较少采用[2,5]。

2 BMSCs的生物学特性

2.1 形态学特征

BMSCs体外培养时细胞形态主要表现为梭形、纺锤形，少数BMSCs为多角形。由于BMSCs细胞贴壁生长的特性，体外培养时其可以贴附于培养皿或培养瓶表面，并形成集落或融合层。原代细胞接种后约1 d就可见细胞贴壁生长，刚贴壁的细胞多为单个，形态多为圆形，首次换液后5～7 d可见集落形成，细胞形态呈长梭形、三角形或星形。原代细胞通常培养10 d左右，可见细胞增殖迅速，两周后每个小集落即可形成由数百至上千个细胞组成的大集落。

2.2 增殖扩增能力

由于骨髓中BMSCs的含量非常少，且数目随着供体年龄的增长或身体情况的衰弱数量会逐渐减少，因此要获得足量的BMSCs必须在体外进行大量扩增。而BMSCs增殖扩增能力较强，故体外培养条件下可以满足大量扩增的需要。2000年Colter等[6]研究表明，BMSCs在低密度条件下培养仍能保持增殖能力。1999年Conget等[7]发现人体内约20%的BMSCs处于静止状态，尽管如此，体内的BMSCs仍能满足增殖分化的需求。将BMSCs以7 000 cm-2的密度接种，4 d后P1代扩增2.4倍，传至第20～25代时BMSCs在细胞形态、生长速率及免疫表型等方面无明显改变，同时每个BMSCs此时大约扩增为5.5×108个细胞。

2.3 表面标记

目前研究表明，BMSCs可以表达许多种细胞表面标记物，如内皮细胞、间质细胞及表皮细胞等的表面标记物。目前已知的BMSCs表达的表面标记物有CD166、CD106、CD102、CD54、CD44、 IL- 1R 、IL- 3R、IL- 4R、IL- 6R、IL- 7R、 IFN- CR、TNF- A、CD49a、CD49b、CD49c、CD104、CD29等。但BMSCs并不表达造血细胞类的表面标记物，如CD3、CD4、CD8、CD14、CD31、CD34、CD45、CD117等，也不表达HLA- DR等。目前，关于BMSCs特异性的表面标记物的结论尚不一致，暂时仍没有标准的表面标记物[8- 11]。

2.4 免疫调节

一般组织器官或细胞移植术后受体可识别移植物抗原发生免疫应答使得移植物的破坏，从而丧失原有功能。但目前大量相关试验发现，BMSCs用于体内治疗时很少出现此类免疫排斥反应。对于BMSCs如何进行免疫调节，目前研究主要倾向以下说法[12]。

2.4.1 低免疫原性 BMSCs由于缺少T淋巴细胞活化所需的第1、2信号传导系统，因此无法表达共刺激分子B71、B72、HLA- Ⅱ类分子及FASL，也不表达CD40和CD41，所以不能诱导T淋巴细胞的增殖。BMSCs分化成各种细胞后始终不表达HLA- Ⅱ类分子，因此也不发生免疫应答。

2.4.2 对免疫细胞的作用 (1) 对T细胞的抑制：Krampera等[13]实验发现BMSCs可以抑制特异性的记忆T细胞与幼稚型T细胞的增殖，但不能抑制抗原反应性T细胞。相关实验证明，BMSCs可分泌IL- 2、IL- 6、IL- 7、IL- 8、IL- 10、IL- 11～15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β等细胞因子[14]，而其中的IFN-γ、IL- 10、TNF-α、TGF-β和IL- 2可抑制T细胞增殖；(2) 对B细胞的抑制：BMSCs可通过抑制B细胞的增殖、活化及IgG的分泌，从而起到对B细胞的调节作用[15- 16]。(3) 对抗原递呈细胞的作用：在抗原的递呈、T细胞增殖的诱导及B细胞向浆细胞转化的过程中，树突状细胞(DC)，且只有成熟的DC发挥着重要的作用。另外，BMSCs可以通过抑制MHC- Ⅱ及T细胞共刺激因子的表达而抑制DC的成熟，最终抑制T细胞的增殖和活性。

2.5 多分化潜能

BMSCs具有多向分化的潜能，在不同的诱导条件下BMSCs可以分化为不同谱系的细胞，如成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等[17],其中BMSCs向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞诱导分化的研究及应用在骨关节领域有着重要的意义。

3 BMSCs的分化机制及影响因素

BMSCs向不同谱系细胞的分化过程受到诸多因素的影响，在不同刺激因素的作用下，BMSCs的分化种类有有着很大的区别。

3.1 成骨细胞分化

Friedenstein等于1976年时实验发现，BMSCs在体外经过数代培养后，部分BMSCs可分化成类似骨或软骨组织的沉积物[18]。1999年时Pittenger等[19]在培养基中加入地塞米松、抗坏血酸及β- 磷酸甘油等，并用培养基诱导培养BMSCs，发现BMSCs可分化为成骨细胞。后来，Ouyang等[20]利用加有抗坏血酸的培养基培养BMSCs，然后将其置入受损部位，3周后观察显示植入物的结构与正常骨膜相似，且BMSCs向成骨、软骨分化。目前研究发现，调节BMSCs成骨分化的因素很多，研究较多的有地塞米松、转化生长因子、维生素C、D3。实验证明，地塞米松可以促进成骨细胞的分化成熟，同时提高碱性磷酸酶活性[21- 22]。同时，地塞米松可以促进BMSCs的矿化作用。除地塞米松以外，研究表明适宜浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)也能有效促进BMSCs的成骨分化，目前TGF-β1也是诱导BMScs分化的首选生长因子之一，其在BMSCs的细胞生长、成骨分化、骨基质合成和骨重建等过程中起着不可或缺的调控作用。另外，骨形成蛋白也是转化生长因子β超家族成员的一员，不过体外骨形成蛋白的作用存在种特异性，其可以促进大鼠和小鼠的成骨分化，但骨形成蛋白2不能诱导人BMSCs的成骨分化。

3.2 成软骨细胞分化

实验证明，利用加入TGF-β、BMP及整合素的无血清培养基培养BMSCs，BMSCs可向软骨细胞分化。在体外培养情况下，BMSCs能分泌软骨细胞特征性细胞外基质，如Ⅱ型胶原、氨基多糖等，这进一步为BMSCs作为软骨组织工程的种子细胞来源提供可能性。除了TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)可以参与调控BMSCs成软骨分化外，还有如地塞米松、维生素C、FGF等，其中地塞米松、TGF-β以及维生素C在其过程中起着重要作用。地塞米松可以增强相关基因的表达，提高软骨细胞外基质标记分子的蛋白质水平，尤其是Ⅱ型胶原的水平。维生素C本身不能诱导BMSCs成软骨分化，却可以通过调节细胞外基质的组成与排列促进细胞的自分泌与旁分泌作用，从而使细胞增殖与转化。转化生长因子(如TGF-β1、β2、β3等)能够促进细胞的增殖、分化，同时可促进细胞外基质的合成分泌。另外，BMP具有诱导BMSCs成软骨分化的能力。实验证明，TGF-β1与BMP2联合时可以更有效地促进BMSCs向软骨细胞分化[23]。

3.3 肌腱细胞分化

实验证明BMSCs具有向肌腱细胞增殖分化的潜能，而BMSCs向肌腱细胞的分化过程离不开多种细胞生长因子的共同参与、生物力学环境的影响等综合因素。参与BMSCs成肌腱分化过程的细胞因子很多，目前已知的有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子- 1(IGF- 1)、转化生长因子- D、骨形态发生蛋白12(BMPl2)等。bFGF是一种重要的有丝分裂因子，它可以刺激血管形成，加快细胞的分化增殖并抑制凋亡。IGF- 1可以加快mRNA的转录及蛋白的合成，促进细胞增殖。bFGF和IGF- 1不仅具有促进成纤维细胞增殖和胶原分泌的能力，也具有促进间充质干细胞向肌腱细胞分化的能力[23- 24]。

BMSCs在向不同谱系分化的过程中，除了生长因子还受着诸多影响因素的影响和调控，如培养方法、微环境、支架材料及基因等等，其中微环境包括BMSCs细胞培养过程中的物理因素、共培养、生物反应器等。研究证明，体外培养时低氧条件下BMSCs向软骨细胞分化的能力更强。关节软骨所在的关节腔是一种低氧的环境，在体外低氧环境下诱导培养的BMSCs向软骨细胞分化，与这种低氧环境模拟了关节腔的生理环境可能有一定的关系[25]。也有一些研究结果显示适当的力学因素刺激对于BMSCs的分化，尤其是成软骨分化方面有一定的积极作用[26]。Mouw等[27]发现一定的力学刺激可以促进TGF-β1的表达，而TGF-β1可以提高BMSCs对力学刺激的敏感性。随着组织工程技术的发展，人们发现良好的支架材料不仅有利于细胞贴附生长，还可以诱导BMSCs的分化过程[27- 29]。许多实验也证明，共培养可以刺激BMSCs的分化增殖，有人将马的BMSCs与软骨细胞以1∶1的比例混合在体外进行细胞团块的培养，结果共培养组的Ⅱ型胶原、蛋白多糖以及SOX9基因的表达高于软骨细胞对照组。其机理可能与共培养细胞分泌多种细胞因子和特异性细胞外基质，以及共培养细胞与BMSCs间的信号传导通路等因素有关。

4 BMSCs在骨外科的应用

基于BMSCs强大的分化潜能及易于分离培养、遗传相对稳定等特性，BMSCs成为组织工程中理想的种子细胞之一，目前在组织工程、细胞治疗等方面的应用日益广泛，尤其在骨科领域也显示出了其不同于传统治疗方式的优越性。

4.1 骨缺损修复

随着组织工程学技术的发展，组织工程学技术在临床上的应用也为临床疾病的治疗提供新的方法。例如治疗骨缺损时可以将BMSCs与支架材料组成的复合物移植到骨缺损部位，从而起到良好的治疗作用。Borden等[30]在多聚微球基质材料中加入BMP- 7及BMSCs并植入大段的骨缺损动物模型中，结果发现其可以诱导新骨的长入，且增强BMSCs的成骨活性。Quarto等[31]将BMSCs与羟基磷灰石构建的组织工程骨植入动物长骨缺损处，结果表明实验组均可完全恢复患肢肢体的功能。大量实验结果表明，将BMSCs与支架材料形成的复合物或组织工程软骨植入体内骨缺损区域后，可直接增强病损局部细胞介导的骨再生能力，快速修复大段骨缺损。目前利用骨组织工程技术，BMSCs在治疗骨缺损等疾病方面为今后临床治疗骨缺损提供了一种新的、有效的可能。

4.2 软骨修复

关节软骨由于缺乏血供且软骨细胞自我增殖能力极弱，因此关节软骨损伤时很难自愈，这也是临床上关节软骨损伤治疗的一重大难题。Wakitani等[32]首次将体外纯化培养的自体BMSCs复合Ⅰ型胶原凝胶植入兔膝关节软骨缺损区域，2周后病灶处即形成透明软骨，24周后关节软骨缺损处得以修复，不过与正常关节软骨相比修复后的软骨更薄，且部分区域缺乏软骨细胞分泌的蛋白多糖。Yoo等[33]将体外培养的BMSCs导入修饰基因，并将其与软骨诱导因子一起注入软骨损伤区域，结果发现受损的关节软骨逐渐得到恢复。随着组织工程技术的发展，人们将BMSCs嵌入支架材料后植入缺损部位，利用支架直接为细胞提供所需的生长因子而获得透明软骨，修复软骨损伤，且修复的软骨与周围组织连接良好[34]。

4.3 肌腱损伤修复

与关节软骨类似，肌腱组织也缺乏血供且修复能力弱，因而肌腱的治疗也是临床一大难题。有人将复合了BMSCs的胶原纤维移植到损伤的肌腱处，发现其可以促进肌腱的修复。已有研究表明，相比于无BMSCs的胶原纤维，复合有BMSCs的胶原纤维修复后的肌腱更粗、胶原纤维束更加成熟，且生物力学性能也更为优越。

5 展 望

随着组织工程学技术的日益发展，人们对于BMSCs的研究已取得了很大的进步，但目前对于BMSCs的研究仅仅刚开始而已，仍有许多难题需要我们进一步的研究，如:(1) 进一步明确BMSCs特异性的表面标记物，建立明确标准,这需要我们对BMSCs分化各阶段的细胞表面标志物进行进一步研究。(2) 找到更加理想的支架材料。(3) 转基因技术的完善，从而发挥转染后靶细胞的更大生物学效应[35]。

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