大豆硬实形成机制与破除技术的研究进展

孙星邈，王 政，李曙光，孟凡凡，王曙明，张井勇

（吉林省农业科学院大豆研究所/大豆国家工程研究中心，长春 130033）

硬实（硬粒hard seed，Hardseededness）是种子休眠类型之一，在植物种子中广泛存在，农作物中最常见于豆科作物。硬实是指由于种皮致密、不透水或透水性差而不能吸胀发芽，又被称为不透水或石种子（impermeable or stone seeds）。

在大多数情况下，硬实并非人们所需要的特性，大豆硬实种子即使经过长时间浸种或在合适的温湿度条件下，长达8d时间种子仍不能吸收水分发芽，这样就会在农业生产中严重影响播种品质，导致发芽延迟，出苗率差，出苗不整齐，进而造成田间保苗密度不同，易于滋生杂草，最终降低了收获产量[1-2]；并且连作时会造成后作大豆种子混杂。此外，在大豆食品加工利用过程中，硬实不仅会影响全粒用型（whole-soy foods）大豆，如豆芽、纳豆、烘烤型大豆食品的感观品质，而且会降低大豆原料在豆腐、味噌（miso，日本豆面酱）、豆浆与酱油等（cracked-soy foods）加工过程中的碾磨品质，剔除硬实种子必然会提高成本[3-4]。因此，在育种实践中，育种者倾向于选育非硬实的大豆品种。

然而，在收获时遇到高温多雨天气，以及对于大豆贮藏、运输和种质资源保存而言，由于硬实大豆质地坚硬种子不易吸收水分，有利于延缓种子劣变、生活力下降，通过将硬实基因引入某些品种，增强种皮保护作用延缓种子老化变质[5]，使得利用硬实特性成为保存种质资源的途径之一[6]。

针对硬实在生产实践、食品加工过程中存在的弊端，以及硬实在防止种子发生劣变方面的优势，从大豆硬实发生的原因与影响因素，解除方法以及应用潜力方面进行讨论。

1 大豆硬实发生的原因与影响因素

1.1 大豆硬实的发生原因

大豆的种皮、种脐、合点、种孔等均与硬实的形成密切相关。

种皮的影响作用最大，其中种皮厚度影响不大，种皮渗透性影响起主要作用。大豆种皮从外到里依次由角质层，表皮层，表皮下层以及薄壁细胞层组成。其中，角质层通常由沉积在种子表面的蜡质、脂质半纤维素或果胶质组成[7]，一定程度上阻碍种子的吸水。Ma等报道了大豆可渗透性种子（正常）与不渗透性种子（硬实）的关键区别，是种子最外面的连续性角质层是否完整[8]。利用扫描电子显微镜技术，发现可渗透性种子的角质层存在细微的裂痕，大多数裂缝在于种子背侧，吸胀时一般是种皮背侧首先出现皱缩；而硬实种子的角质层保持完整，没有裂痕，使得水分不能通过种皮的角质层。此外角质层之下的表皮层又称栅栏层，其细胞内的纤维质物质及栓化层可在栅栏层外端形成致密区域，对种皮的不透性具有重要作用[9-11]。Meyer等进一步证实种皮缺乏透性是硬实种子吸取水分的限制因素[2]，硬实种子种皮的导水率小于非硬实的导水率；除去种皮后，硬实与非硬实种子单独的种胚吸收水分的速率相当。

当处于潮湿条件时，种子种脐、合点、种孔等结构关闭会阻止外界水分和水汽进入，这是形成种子硬实的另一主要原因[10,12]。种脐是鉴别豆科种子稳定的重要特征，脐缝处可能有两层栅栏层细胞，其中一层位于角质层外侧，称为反向栅栏层，他会形成一个控制水分进出的阀门结构，只允许水分散出而阻止其进入。朱丽伟等证明不论在何种相对湿度条件下[13]，硬实种子的种脐脐缝宽度均显著小于非硬实种子，且随环境改变硬实种子的脐缝变化幅度小于非硬实种子。

大豆种皮中较高的钙质含量也是形成硬实的重要原因之一。Chen等证明种皮钙质含量与种子硬实呈正相关[14]，但是受到土壤类型、温度变化等环境影响而表现不一致。朱丽伟等对多种豆科植物硬实种子研究也发现硬实种皮中的大部分矿质元素（Mg、Al、Si、K、Ca、Fe、Cu、Zn等）含量均显著高于非硬实种子[13]，推测高的矿质元素含量增加了硬实种子的耐压能力，种皮不易产生裂缝，进而降低了渗水性形成硬实。

1.2 大豆硬实的影响因素

大豆种子的硬实形成受内部因素和外部因素的共同制约。内因主要为种子成熟程度和自身遗传因素；外因包括成熟过程中土壤水分和养分供应情况以及收获之后贮藏、运输过程中的空气相对湿度和温度变化等外界环境因子。

1.2.1 影响硬实内部因素 硬实的形成和种子本身的成熟度有关，未充分成熟的种子不会发生硬实，硬实是种子成熟到一定程度才出现的，这一现象与种子的含水量有关。随着种子的不断成熟，含水量逐渐降低，种皮外层的厚壁栅栏细胞开始发育，种皮逐渐硬化，完全成熟时栅栏细胞收缩引起硬实产生[12]，许多豆科植物均在此时产生休眠[15-16]。

研究表明这一系列的变化受遗传控制，但在显隐性关系和基因数目上结论均存在争议。早期研究认为种子的吸水性至少是部分显性或为1个显性单基因控制；Kilen和Hartwig利用大豆“Tracy”（非硬实）דD67-5679”（硬实）正反交组合[17]，认为硬实受3个主基因控制，软实对硬实为显性；Verma和Ram对6个亲本正反交各自产生的F1、F2、F3代籽粒进行种子渗透性分析[18]，同样认为软实对硬实为显性，但不同组合受不同数目的显性基因控制。张太平等研究D86-4448（硬粒）×商用大豆品种A6297（正常粒）的F2群体则认为，硬粒性状受2个主基因控制，基因间有累加效应，硬实为显性。Shahi和Pandey认为该性状受1个基因控制[19]，但显隐关系研究与选用品种有关，亚种间杂交时，硬实为显性，品种间杂交时，硬实为隐性。因此在经典遗传学水平研究硬实，由于试验材料遗传背景不同，得出的结果有较大差异，同时也说明了硬实性状受基因控制的复杂性。

随着分子遗传研究的开展，硬实逐渐被作为复杂数量性状进行研究，Keim等在亚种间杂交时[20]，5个RFLP标记以及这些标记间上位性互作可以解释71%的硬实遗传变异，鉴定了i位点（QTL）可解释该分离群体32%的遗传变异；Zhang等利用874个SSR标记发现了多环境下稳定遗传的2个QTL（Ha1和Ha2）[4]，分别位于LGL、D1a连锁群上，目前正在多个遗传背景下进行验证。

1.2.2 影响硬实外部因素 大豆生长后期的环境，包括地区的气候、降雨、灌溉、太阳光辐射和土壤钙质含量等因素均会影响硬实的发生。结荚鼓粒期是大豆需水的关键期，高温干旱不仅会影响水分吸收和营养物质的积累，造成高温逼熟，饱满度差，落荚严重，豆荚空瘪率高，大豆减产严重，而且会大大增加硬实率，Vieira等在试验中发现干旱胁迫下大豆硬实种子比例增加[21]，这一现象在小粒型种子中尤为明显，成熟时干旱会使种子的萌发推迟3d左右。马盾和刘健研究显示秋大豆一般比夏大豆硬实多[22]，推测也是由秋大豆在干燥季节成熟引起。基于硬实对干旱条件的敏感，灌溉条件也会对硬实产生明显影响，季良和张振泰对北疆地区灌水模式进行研究发现[23]，灌水量和灌水次数均会影响大豆硬实情况，即较少灌水量对大豆硬实形成影响显著，在同一灌水次数下，灌水量越大，硬实率越低，偏旱年份灌水量对硬实率的影响大于灌水次数。另外土壤中钙质含量高，硬实就多；钙质含量少，硬实种子就少[12]。太阳光辐射时间越长，强度越大，硬实率也越高[24]。

成熟收获后的贮藏条件也会对硬实形成产生重要影响，湿度与温度是贮藏中形成硬实的2个最重要的外部因素。非硬实的种子，随着进一步干燥，会造成二次休眠，因此贮藏时相对湿度降低会增加种子硬实率，在菜豆冬季贮藏试验中，当含水量由16%降到10%时，有近半数的种子会形成硬实[25]。这种现象可能是因为含水量降低可使种皮栅状细胞更加收缩，结构更为紧密造成的。除干燥条件会影响种子的休眠和硬实外，恒温贮藏时，温度较高则休眠率下降较快[26]。

2 大豆硬实的破除方法

2.1 机械划破种皮

采用机械处理的方式擦破种皮可能是最为普遍的处理硬实种子的方法，划破种皮使得空气和水分能够透过种皮，促使种子快速吸水和萌发。当处理少量的大粒种子时，可以在除种脐以外种皮上侧向切掉一小块至露出子叶，李忠贤利用刀片划破硬实大豆种皮[27]，除个别种子霉烂外，平均发芽率达到96%以上，由此说明机械方法对于破除硬实效果明显。批量处理也可在采用砂纸磨擦、在研钵中与粗砂混匀研磨及机械磨擦的方法，但处理程度应损伤种皮但不伤及种胚部位，因此不宜处理大批量大粒种子。在处理批量的种皮较薄的小种子可选用硬实种子碰撞机、小型种子磨擦机、电动磨米机等磨伤种皮打破硬实[28]。

2.2 温度处理

温度的变化可改变大豆种皮透性，可破除休眠并改变发芽率。将种子置于高温（热水）中一段时间后冷却是破除休眠的主要方法之一。但每一种豆科植物种子都存在一个休眠破除的临界温度[29]，因此处理的具体时间和温度需根据种子大小与种皮厚度而定。除高温处理外，低温处理也可破除硬实、结束休眠；具体方法包括冷冻处理和低温层积。冷冻处理后可改变种皮透性，也可用液态氮处理；低温层积是将种子在较低温度下置于湿润的发芽床或其他基质中层积处理，可在豆科牧草打破硬实过程中应用，郑月萍对野生大豆研究也发现，4℃的层积处理80d可显著破除种子硬实，萌发率显著上升。

2.3 干湿交错处理

将浸泡和干燥交错进行，多次反复后种皮既吸胀又收缩，可破坏种皮结构，提高种皮透性，适于处理大粒种皮较薄的硬实大豆种子。生产上通常是将硬实种子置于水中浸泡，白天放在太阳下曝晒，夜间转至凉爽处，多次反复，当大部分种子膨胀时根据墒情播种。

2.4 化学处理

浓硫酸和高浓度NaOH可以腐蚀局部种皮，增大种皮的透性，有效打破种子休眠，其中浓硫酸处理较为常用。化学处理方法经济有效，但由于强酸、强碱对种胚的腐蚀伤害，应用此方法存在3点问题：（1）不同硬实种子耐受酸碱能力不同，特别是浓硫酸处理速度较快，对于种皮较薄的种子处理时间较难控制；（2）化学残留对种子危害大，处理后的冲洗要彻底；（3）虫害较严重但仍有萌发能力的种子，强酸、强碱容易通过伤口伤害种子，不适用此方法。所以在批量处理种子前，一定要进行预备试验，确定合适的处理时间和使用浓度，避免达不到预期效果或者伤害种子本身[12,16]。

3 大豆硬实的应用潜力

在农业实践上，硬实种子坚硬的种皮有利于种子在很长时期内保持较强的活力，对于控制种子的休眠萌发和延长种子寿命具有重要的指导意义。

种皮阻碍了水分和空气的扩散，在成熟收获之前，遇到不良天气情况，硬实可防止种子循环吸水和干燥；在开放贮存情况下，硬实延缓了吸取周围环境中的水汽，而且还可以抵抗贮存时温度和湿度的波动对种子的损伤[30]。Heatherly等针对经历高温高湿等不利存放条件[31]，普通大豆种子发芽率下降的情况，对两地硬实大豆种子和非硬实种子试验发现，置于同等不利条件下20d后，非硬实种子发芽率下降超过70%，但硬实种子发芽率仅下降20%左右，证明硬实大豆种子在自然环境下可更好的保持发芽率。王金龙等试验验证了大豆种子的储存寿命，证明为保证生活力非硬实种子仅可在室温下保存2a，但硬实种子室温贮存4a仍可保持发芽率。且硬实种子遗传基础未发生改变，不影响后代植株的植物学性状。

因此硬实对种质的保存是有利的，有目的地选育具有部分程度硬实的品种，可以提高种子的生活力；同时可以通过制造干燥和低温环境形成硬实，贮藏珍贵大豆材料。

4 小结与展望

硬实是大豆种子中常见的休眠特性，种皮缺乏透性是硬实大豆形成的主因。硬实是种子处于逆境下的一种自我保护，在不同遗传条件、大豆生长后期的环境条件以及贮藏条件下有不同表现。在多数情况下硬实并非人们所需，加工产业可选用非硬实品种提高产品品质并降低成本；生产实践上为获得高出苗率，除利用育种手段选育非硬实品种外，还可使用机械、温度、干湿交错和化学等处理方法打破硬实大豆种子的休眠。但在种质保存过程中可对种子硬实特性加以利用，发挥坚硬种皮的保水作用。

在大豆研究中对硬实特性有清晰、深入的认识可更好的解决生产实践、加工和种质保存上的诸多问题。但目前对硬实的应用性研究多于基础理论研究，而且对硬实形成的研究主要针对种子及种皮的形态结构，对硬实的遗传研究开展较少且结论争议较大。未来的研究还需进一步解析硬实复杂的遗传机制，为选育硬实和非硬实品种提供更多的理论依据，更好的控制并利用这一特性。

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