颌面部发育畸形与维甲酸及信号分子通路

肖 晶

(大连医科大学 口腔医学院 口腔基础教研室，辽宁 大连116044)

颌面部发育主要经历5 个阶段，首先是在外胚层和神经外胚层交界处的颅神经嵴细胞(cranial neural crest cells，CNCC)被诱导，游走并迁移到面部始基，随后CNCC 的区域性增殖导致面部原基的外向性生长，即面部突起的形成，然后面部突起融合初步完成了面部形态，最后骨骼的定向生长决定了面部的外形［1］。

1 颅颌面部骨骼的发育、腭裂的形成及分子机制

1.1 颅颌面部骨骼的起源、发生及分子机制

颅颌面部骨骼大部分来源于神经褶背侧边缘的颅神经嵴，少部分细胞为中胚层来源［2-4］。以小鼠为例，其额骨是神经嵴来源，顶骨是中胚层来源，衬在额骨和顶骨内的硬脑膜来源于神经嵴，而冠状缝和矢状缝处的结缔组织则来源于中胚层。颅颌面部骨包括脑颅骨和面骨，面颅以及脑颅顶和两侧的骨头由膜内骨化形成，而支撑颅底骨大多由软骨内骨化形成。颌面部大部分骨通过膜内骨化方式成骨，如上颌骨，下颌骨体。

CNCC迁徙至鳃弓和额鼻突后，与原有的中胚层构成外胚层间充质，在相邻上皮作用下，外胚间充质细胞发生移行、识别、聚集及增生，进而形成凝集区。凝集区的细胞进一步产生细胞外基质并分化成骨和软骨。CNCC 最终能否分化成骨细胞，取决于其与上皮细胞间的相互作用。在此过程中，基因和转录因子如Barx1，Dlx1，Dlx2，Dlx5，Msx1，Hoxa2，Hoxa3，Twist，BMP4，TGFα［5］及维甲酸的目的基因Hoxa1，Hoxb1 和其相关转录因子AP -2，Pax3 等对形成颅面骨形成过程中神经嵴细胞的迁徙和分化起重要作用［6］。

在颅颌面骨的发育中，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)的调控较为重要且研究较深入［7-8］。哺乳动物的FGF 基因家族有22 个成员，人和鼠FGF 受体(FGF receptor，FGFR)有4 种基因型(FGFR1 ～4)，绝大多数的FGF 作为细胞外蛋白，通过结合并活化细胞表面FGFR 发挥作用。在脊椎动物中4 个FGFR 基因产生7 个FGF 受体蛋白，即FGFR1b、1c、2b、2c、3b、3c 和4，各自均有不同的配体特异性，每种FGFR 至少可以被5 个FGF 配体激活［9］。FGFR1 和FGFR2 在发育中的颌面始基广泛地表达。FGFR1 功能衰减但不完全消失，小鼠出现许多头面部骨和软骨的畸形，而且80%发生腭裂。通过将神经嵴细胞中的FGFR1 亚等位基因恢复到野生型可以修复已发生的发育缺陷，这也证明了FGF 信号分子在面部始基中的神经嵴细胞分布以及模式发生中是不可或缺的［10］。FGF8 与维甲酸关系密切［11-12］，并在颌面部早期的模式发生中起重要作用。在面部始基活跃生长时(E10.5)，FGF8 基因突变小鼠表现为心脏发育异常以及广泛的头颅面畸形。在早期面部发育和前脑形成中，FGF8 是Wnt/β-catenin 通路的目的基因［13］。过量或缺乏维甲酸可引起发育畸形，而且在胚胎早期发育中，除了FGF8，维甲酸与SHH 以及WNT 信号密切相关［11-12，14］。

1.2 腭的发育

腭的发育是一个动态的过程，被分为垂直生长期，上抬及水平生长期及接触融合期。在人胚胎第6 周末(小鼠胚胎11.5 天，E11.5)，从左右两个上颌突的口腔侧中部向原始口腔内各长出一个突起，称侧腭突或继发腭，是继发腭的形成起始期;在胎儿第6 周晚期至第7 周早期(小鼠E12.5 -E13.5)，两侧的侧腭突向中线方向生长，但由于此时舌发育得很快，形态窄而高，几乎完全充满了口鼻腔，并且与发育中的鼻中隔有所接触，所以侧腭突很快便转向下即垂直方向生长，称垂直生长期，此时的侧腭突位于舌的两侧;在人胚胎第7 周晚期至第8 周早期(小鼠E14 -E14.5)，由于下颌骨的生长发育使其长度和深度有所增加，头颅向上抬高以及侧腭突内细胞的增殖等因素，舌的形态逐渐变为扁平，位置下降进入口腔之中，随之，侧腭突发生水平向的转动并朝中线方向生长，即上抬及水平生长期;人胚胎第8 周(小鼠E14.5 -E15.5)，左右两侧的侧腭突与前腭突自外向内、向后方逐渐融合并与向下生长的鼻中隔发生融合，即接触融合期［15-16］。

腭裂发生的原因一是由于腭突内部的缺陷，二是继发于颌面部其他组织的缺陷，如临床上颌发育不足和下颌后缩，导致舌位置异常，从而物理性地阻碍腭突上抬，最终导致腭裂［4］。

腭中嵴上皮(middle edge epithelium，MEE)细胞是腭突融合前位于腭突近中边缘嵴的外胚层细胞［17］，其转归形式的改变可能与腭裂发生关系密切。MEE 细胞在融合期发生凋亡，从而使两侧EPM细胞互相长入，完成腭突的最终融合。本课题组以往的研究发现:在腭突的接触融合过程中，在对照组，双侧腭突沿水平方向生长延伸，两侧腭突接触后，MEE 细胞形成腭中嵴上皮带，后断裂形成上皮岛，MEE 细胞发生凋亡，MEE 逐渐消失，双侧腭突的间充质相互贯通;在E10 给予维甲酸，胎鼠双侧腭突形态发育障碍，未相互接触，腭突内MEE 细胞未发生凋亡，而分化为口腔样复层鳞状上皮。

2 舌的来源及发育机制

舌的结缔组织及血管结构来源于CNCC，其触发了舌始基的形成，而且对舌间质结缔组织有作用，这些结缔组织最终将舌肌分隔并为其提供附着点。研究表明:CNCC 比舌肌细胞先到达舌原基部位，只是包围在舌肌细胞周围。CNCC 来源的间充质在发育过程中的两个主要作用:(1)为舌肌细胞的组织、迁移提供支架;(2)调控舌肌细胞的生存、增殖和分化。舌肌细胞起源于轴旁中胚层的体节，枕区第2至5 体节腹侧细胞丧失其上皮细胞形态，变成单个细胞，即形成肌原祖细胞。来自不同体节的肌原祖细胞形成单向细胞流，沿特定部位——舌下神经，迁移至舌原基部位。舌肌原祖细胞迁移到第一腮弓和舌原基不需要CNCC 的参与。当肌原祖细胞进入颅面部，就与CNCC 紧密接触。这种关系在舌形态发育的整个过程都存在［18］。

舌的组织结构和功能的主体是舌肌，舌肌属于骨骼肌。四肢和躯干肌肉的发育过程和分子机制已经进行了广泛的研究，这些为颌面部肌肉的发育提供了信息。骨骼肌发育经历一系列过程，包括确定、迁移、增殖、分化和成熟。其发育分化的过程可分为以下几个阶段:前体细胞期、成肌细胞期、从成肌细胞分化成为合胞肌管的肌管期以及分化成熟后进入肌纤维期。这些过程通过内在信号因子如Pax3，Pax9 以及成肌调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)的调节，包括MyoD，Myf5，Myogenin 和Myf6(也称MRF4 或herculin)［19-20］。MRFs 均为MyoD家族基因所编码，MyoD 家族是bHLH 蛋白家族中的重要一员，多数骨骼肌受bHLH 的调节。成肌调节因子成员Myf5 和MyoD 基因在增殖的未分化肌原细胞中都有表达，控制着成肌细胞的分化方向，Myf5还对未分化的肌细胞如肌卫星细胞起到维持作用，MyoD 则在肌生成早期参与肌管形成。Myogenin 在肌管形成中通过控制成肌细胞的融合和肌纤维的形成对肌分化起关键作用，而Myf4 则与肌纤维的成熟和保持有关［21］。因此，MRFs 与肌原纤维粗丝的组成单位——肌球蛋白(Myosin)一起常被作为骨骼肌发育分化的标记物。

舌复杂的来源及其重要的功能使得研究虽然困难却很有价值。虽与躯干和四肢肌来源不同，舌肌的发育仍需要成肌调节因子的调控［22］。舌发育早期，间充质中可检测到Fgf7 和Fgf10 的高表达，表明它们是舌发育时期的主要配体。Fgfrs 和某些Fgfs在舌旺盛增殖时期的高表达，可能是在胚胎早期发挥促有丝分裂的作用。Fgf2 在胚胎晚期以及出生后的舌肌中仍能检测到，提示其与舌的分化也相关［23］。神经嵴细胞即非肌原细胞中缺乏Tgfbr2 导致小舌畸形，Fgf10 表达下调，成肌细胞增殖减少，舌肌细胞数量减少以及舌肌组织紊乱［24］。TGF-β 通过细胞自分泌的方式诱导Scx 的表达，通过调节神经嵴细胞分泌生长因子以及组织之间的相互作用调控成肌细胞的增殖。另外，TGFβ -Smad4 -Fgf6 信号级联调控舌肌的成肌分化以及肌细胞的融合［25］。到目前为止，对于调控舌肌发育的分子机制仍知之甚少。

3 腭、舌发育过程中的互动及关联

舌是参与发音与吞咽等功能的重要器官，舌的正常发育对口腔内相关结构的正常发育是很重要的，尤其与腭的发生过程密不可分。以小鼠为例，E11.5 天腭突与舌几乎同时进入发育起始期，舌始基在口腔底部隆起;E12.5 天(相当于腭突垂直生长期)侧腭突与舌共同经历快速增殖期，舌继续增大并占据整个口腔，但尚缺乏组织分化;之后舌间充质出现区域性密集，少数细胞伸长分化为成肌细胞。在E14 ～14. 5 天，腭与舌二者经历关键的位置互动，舌的形态逐渐变为扁平并下降释放出空间后，原先在舌两侧垂直向生长的侧腭突才可发生水平向翻转并朝中线方向生长。至E15 天，当侧腭突逐渐向中线靠拢时，舌肌分化完成，肌细胞成束排列，胞浆内出现较多肌原纤维，舌肌收缩给予腭部压力，并促使腭最终关闭［26-27］。因此，腭突与舌发生位置互换、水平向转动及腭关闭的发育过程均依赖于舌与腭的协调运动。在小鼠动物模型中，腭的发育(E13.5)较舌(E11.5)开始的较晚。胚胎期舌的快速下降是腭正常发育的关键，这一过程的延迟可能扰乱了正常的腭突的上抬，进而可能导致腭裂。

如前所述，TGF -β 通路不但参与包括舌肌在内的骨骼肌的发育，而且与腭发育相关，Tgfbr2 基因敲除小鼠发生腭裂［28］。RA 可提高TGF -β2 杂合子小鼠腭裂的发生率，可诱导鼠腭胚间充质细胞表达TGF-β2 mRNA 及蛋白，诱导的TGF -β2 至少可部分介导RA 对这些细胞增殖的抑制作用。RA信号通过其(RARE)抑制心肌的Tbx2 -Tgfβ2 通路从而参与心脏血管的发育［29］。这些信息提示，信号分子的协同作用，共同参与包括腭和舌在内的口腔颌面部发育。

4 维甲酸通路与腭裂及舌发育异常的相关性

4.1 维甲酸通路

维甲酸(retinoic acid，RA)是维生素A 的衍生物，包括多种同分异构体，如全反式RA(ATRA)、9 -顺式RA、3 -4 双脱氢RA 等。在RA 信号通路中，通过与其膜上受体结合，被RA 结合蛋白(cellular retinol - binding proteins，CRBPs)从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位，RARs 和RXRs 两个家族均为核内受体，每个都包含由不同基因编码的α、β 与γ3 个亚类。与受体结合后，核内的维甲酸受体(RA receptors，RARs)和视黄醇X 受体(Retinoid X receptors，RXRs)的二聚体RAR/RXR 的配体结合域发生结构变化，继而启动由RNA 多聚酶Ⅱ、TATA结合蛋白(TATA -binding protein，TBP)和TBP 相关因子(TBP associated factors，TAFs)构成的转录前起始复合物而调控下游靶基因的功能。与受体结合的靶序列被称为维甲酸效应元件(RARE)，它一般存在于靶基因的启动子及调控顺序部分［11-12，14］。维甲酸信号的功能最终是通过基因转录调控来实现的，如生长因子、细胞因子及其受体、激素、转录因子、激酶等，都受维甲酸的调节。随着研究的深入越来越多的RA 靶基因被发现，如Fibroblast growth factor 8(Fgf8)，Sonic hedgehog(Shh)，Left -right determination factor 1 (Lefty1)等信号分子，生长激素、同源框基因以及一些核受体等［11-12］。

RA 的表达水平和分布受其合成酶(Raldh1，2，3)和分解酶(Cyp26a1，b1，c1)的严格控制，从而形成一定分布梯度以调节胚胎的模式发生和分化［11-12，14］。在研究较多的后脑节段发育过程中，信号分子和RA 合成酶及分解酶呈明显的梯度分布模式，例如一种基于降解的分布模式:首先RA 的初始产物受Raldh2 的正调节，之后RA 又正调节Cyp26以使自身降解，同时又受FGF 信号通路的负调节，可以说RA 的浓度梯度受两种相斥作用因子梯度分布的影响［11］。

4.2 维甲酸通路在腭裂及舌发育异常中的作用

RA 与WNT、FGF、TGF 及SHH 等信号分子通路共同参与颌面部发育的调控，在模式发育、面突和鳃弓的分化及融合过程中有严格的时间和空间顺序［30］。过多量或过少的维甲酸都会引起发育畸形［12］。由于被广泛应用为恶性肿瘤和皮肤疾病的治疗药物，怀孕的母亲很容易通过各种途径接触和摄入，RA 成为新生儿颌面畸形的较常见环境因素［31］。RA 导致畸形机制主要是影响神经嵴细胞的游走，通过干扰DNA 合成而抑制间充质细胞的增殖，并导致腭突间充质的异常凋亡，引起包括腭裂在内的颅颌面先天性发育缺陷［32-34］。维甲酸的功能是通过与其相应的膜上受体结合，通过细胞浆内的维甲酸结合蛋白运输到细胞核内，最终通过影响基因转录的调控来实现的。Wnt、FGF、BMP 和Shh 等信号分子通路中的重要基因都已被证明参与到维甲酸致腭裂的发病过程。

维甲酸诱导的腭裂伴发舌发育异常(本课题组未发表数据)。有趣的是，维甲酸通路及其相关基因被敲除后也出现了舌发育异常和/或颌骨发育畸形所导致的腭裂。T - box 转录因子成员Tbx1 是DiGeorge/Velo-cardio -facial 综合征的候选基因，该综合征是人类最常见的染色体缺失型先天性遗传病，常伴有心脏畸形和腭裂，Tbx1 基因缺陷小鼠的表型与人类相似，且维甲酸合成的减少，成肌调节因子MyoD 和Myf5 在咽弓不表达，并出现第一腮弓来源的下颌舌骨肌和二腹肌前部缺失或发育不全，虽然腭发育相对正常，但张口和降下颌肌群导致张口受限，使腭板不能上抬而发生腭裂［35-36］。Homeobox (Hox)是一类具有同源异型盒结构特点的转录因子，是维甲酸通路的重要靶基因。在Hoxa2突变小鼠中，出现了舌骨舌肌与舌骨附着异常导致舌不能下降，以致于干扰腭板上抬和融合导致腭裂发生［37-38］。Satb2 已被发现是Hoxa2 上游基因，可与Hoxa2 基质连接区结合而直接调控Hoxa2 基因。SATB2 基因是人类2q32 -q33 删除相关的腭裂以及颌面发育畸形的候选基因［39］，Satb2 基因敲除小鼠也出现了腭裂和舌畸形的表型，并引起Hoxa2 在额鼻部的表达上调［40-41］。并有报道Satb2 与颌骨发育相关，Satb2 基因缺失导致颌面部间充质凋亡和与颌面发育基因Pax9，Alx4 及Msx1 表达模式的改变［42］。Sonic Hedgehog(Shh)信号分子通路被报道直接参与维甲酸对胚胎发育的调控，也是RA 的靶基因。Shh 通路中的Gli3 基因敲除小鼠出现腭裂以及舌形态与位置异常，但Gli3 基因敲除小鼠腭板在体外进行器官培养时，腭板可相互接触融合，提示舌发育异常是导致Gli3 敲除小鼠腭裂发生的原因［43］。

5 结 语

维甲酸作为抗肿瘤药物已被临床上广泛应用，但它对先天性发育畸形的致畸作用也不容忽视，尤其对颌面部发育的影响至关重要。关于维甲酸的靶分子的信息尚不完全清楚，信号分子之间的关系仍然纷繁复杂。对维甲酸诱导的先天性发育畸形动物模型的生物信息学分析显得尤为重要，本课题组近期内将同一模型组织的micro RNA 芯片结果与基因芯片结果加以比对后，发现非常有趣的对应关系，这将为揭示维甲酸致先天性发育畸形的机制提供新的视角，同时为维甲酸临床应用以及先天性发育畸形的预防和再生修复提供支撑。

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