绿头鸭IFN-α的可溶性表达及其活性分析

刘澜澜庄艳娜于晓红曾祥伟

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040；2.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨 150040）

绿头鸭IFN-α的可溶性表达及其活性分析

刘澜澜1庄艳娜2于晓红1曾祥伟2

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040；2.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨 150040）

为了利用原核表达系统研制有生物活性的鸭IFN-α。以pMD18T-MaIFN-α为模板扩增绿头鸭IFN-α成熟肽基因，将其克隆至原核表达载体pET-32a中，在大肠杆菌BL21中进行变温诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果，并用Western blotting进行验证。Ni2+树脂柱纯化目的蛋白后，测定其生物活性。结果表明，重组pET-32a（+）-MaIFN-α在大肠杆菌BL21成功表达，主要以可溶性形式存在，Western blotting分析显示目的蛋白具有良好的抗原性。细胞病变抑制法测定重组鸭IFN-α的抗病毒活性约为8×104U/mL；荧光定量PCR方法检测显示表达的重组鸭IFN-α使NDV在DEF上的复制受到了明显的抑制，48 h时间点相对抑制率高达91%。这些都表明表达的重组鸭IFN-α具有良好抗病毒活性。

绿头鸭 IFN-α 可溶性表达 活性分析

干扰素（Interferon，IFN）是具有良好的抗病毒、抗肿瘤活性和免疫调节作用的细胞因子［1-3］。目前IFN可分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型IFN 主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ξ 和τ 等，Ⅱ型IFN 只有IFN-r一种［4］。其中α-干扰素以其突出的抗病毒效应而备受重视，其抗病毒、抗肿瘤活性作用要明显强于Ⅱ型IFN；同时也具有一定的免疫调节作用，但要弱于Ⅱ型IFN。

鸭IFN-α的开放阅读框架由576个核苷酸组成，编码191个氨基酸，前30个氨基酸为信号肽，后161个氨基酸为成熟活性蛋白。1995年Schultz等［5］首次成功克隆了鸭I型干扰素基因。国内从2000年开始陆续有关于鸭干扰素的报道，目前北京鸭、番鸭、绍兴鸭和四川麻鸭等的序列先后被克隆和测定［6-9］。国内学者也先后利用不同表达系统表达了鸭IFN-α，原核表达重组鸭IFN-α蛋白表达量较高，

但多以包涵体形式存在，需要经过复性才能获得其生物活性［8］；真核表达系统表达重组鸭IFN-α蛋白具有较好的生物活性，但表达量很低。这些都限制了鸭IFN-α在临床实践中的大量应用。获得高表达量并具有活性的鸭IFN-α是目前亟待解决的问题。

本研究尝试对绿头鸭的IFN-α成熟肽基因进行表达，仍然应用原核表达系统，但是通过变温诱导来优化表达条件，力求减少包涵体的形成，增加融合蛋白的可溶性，旨在获得具有较高生物活性的鸭IFN-α重组蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体菌株、毒株和试验动物 含有绿头鸭IFN-α基因的重组质粒pMD18T-MaIFN-α、pMD18TDNV-F由本实验室构建并保存，原核表达载体pET 32a（+）、感受态E.coli BL21受体菌购于美国Invitrogen 公司。新城疫病毒（NDV）F48E9株、水泡口炎病毒（vsv）、鸭胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.1.2 试剂 DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶EcoR I、Hind III、Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、 One Step SYBR® PrimeScriptTMRT-PCR Kit II、蛋白Marker等购自大连宝生物公司。抗His标签单抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG 购自Sigma公司。

1.1.3 引物 参考GenBank上发表的鸭IFN-α基因（登录号：X84764）和NDV的F基因（登录号：AY508514）相关基因序列，设计了2对引物。其中IFNA-F、IFNA-R用于扩增鸭IFN-α成熟肽基因上游引物分别加入了EcoRⅠ、Hind III酶切位点（酶切位点用下划线标注）；Ffp、Frp用于扩增新城疫病毒（NDV）的F基因。引物由上海英骏公司合成，具体见表1。

表1 本研究中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1 原核表达重组质粒的构建及目的基因的表达 以pMD18T-MaIFN-α为模板，以IFNA-F、IFNA-R为引物，使用Ex Taq酶对鸭IFN-α成熟肽基因进行常规扩增反应，将扩增产物和原核表达载体pET-32a（+）分别用EcoRⅠ和Hind III双酶切，回收、连接，构建重组表达质粒pET-32a（+）-Ma-IFN-α，并且测序鉴定重组质粒的正确性。将鉴定后的阳性重组质粒转化入E.coli BL21感受态细胞中，进行变温诱导表达，在新鲜的含有Amp+的LB培养基中37℃震荡培养，当菌液OD600nm达到0.6时，加入IPTG，使其在菌液中的终浓度为0.5 mmol/L，25℃诱导表达6 h。然后进行SDS-PAGE分析。

1.2.2 表达产物的Western blotting鉴定 将SDSPAGE凝胶电泳的蛋白带通过半干法转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉配制的封闭液中，4℃封闭过夜，以封闭无关蛋白结合位点。一抗使用抗His标签鼠单克隆抗体、二抗为HRP-羊抗鼠IgG，进行Western blotting检测，使用DAB显色试剂盒显色。

1.2.3 重组蛋白的可溶性分析与纯化 收集10 mL诱导后的菌液沉淀，经PBS洗涤后重悬于10 mL PBS（pH8.0）中，加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min。冰浴后进行超声细胞破碎（350 W，工作2 s，间隙3 s，作用10 min），之后4℃10 000 r/min离心20 min，分别收集上清和沉淀，沉淀用等体积量的PBS溶解，SDS-PAGE电泳分析。按照His.Bind纯化试剂盒说明书，利用Ni2+树脂柱对原核表达的鸭IFN-α进行纯化。并利用紫外分光光度计对纯化的蛋白进行浓度的测定。

1.2.4 细胞病变抑制法测定IFN-α重组蛋白抗病毒活性 制备鸭胚成纤维细胞（DEF），待长成单层后每孔加入5×102、1×103、2×103、4×103、8×103、

1.6×104、3.2×104和6.4×104倍稀释的纯化后的鸭IFN-α 0.1 mL，每个稀释度设6孔平行样，37℃作用过夜，每孔加入100TCID50的剂量的水泡口炎病毒（vsv）感染细胞。同时设立病毒组、干扰素+病毒组、空白对照组，24-48 h内观察结果，在阳性对照孔出现75%以上病变时，判断结果。以能抑制50%细胞病变的样品的干扰素稀释度定义为一个单位干扰素。

1.2.5 荧光定量PCR方法检测 IFN-α重组蛋白抗病毒活性 试验分为3组：第1组正常生长细胞组；第2组NDV接种组（细胞接种NDV病毒）；第3组保护组（加重组蛋白后再接种病毒）。将单层DEF细胞中的培养液去掉，第1、2组接入等量维持液，第3组加入10倍稀释的重组蛋白2 mL。过夜培养后，第2、3组接种100TCID50的NDV。在接毒的6 h、12 h、24 h和48 h，以Ffp、Frp检测引物，应用荧光定量RT-PCR方法检测DEF中NDV的含量；同时按照Reed-Muench两氏法测算病毒的滴度。反应完成后根据其Ct值，按标准曲线换算病毒核酸拷贝数来反映IFN-α重组蛋白抗NDV病毒的效果，用SPSS15软件进行数据分析，并计算相对抑制率：

相对抑制率（%）=（接种组病毒含量-保护组病毒含量）/接种组病毒含量×100%。

2 结果

2.1 重组质粒pET-32a-MaIFN-α的鉴定

重组质粒pET-32a-MaIFN-α经测序，结果显示插入的MaIFN-α基因大小、序列和开放阅读框架均正确无误，表明成功构建了pET 32a-MaIFN-α原核表达重组质粒。

2.2 重组鸭IFN-α融合蛋白的表达

pET-32a-MaIFN-α重组质粒转化E.coli BL21感受态细胞中经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析（图1）显示出现了一条特异的蛋白质增强条带，大小约为39 kD，与预期结果一致，而空载体对照中并无此条带，由此说明重组鸭IFN-α融合蛋白成功表达。

图1 表达重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 表达产物的Western blotting鉴定

对pET-32a-MaIFN-α融合蛋白进行Western blotting分析，结果（图2）发现在分子量约为39 kD处出现一条特异条带，表明融合蛋白能与His标签鼠单克隆抗体发生特异免疫反应，具有良好的抗原性。

图2 表达重组蛋白的Western blotting分析

2.4 重组蛋白的可溶性分析和纯化

SDS-PAGE电泳分析显示破碎受体菌的上清和沉淀中均有目的蛋白表达，但沉淀中目的蛋白很少，而上清中的目的蛋白含量很多，经蛋白扫描系统分析，目的蛋白越占总蛋白的70%，可见该重组蛋白以可溶性表达为主。

表达的重组蛋白纯化后，经SDS-PAGE分析，结果（图3）显示在大小约为39 kD处可见一条清晰的蛋白带，经测定蛋白浓度约为0.98 mg/mL。

2.5 细胞病变抑制法测定IFN-α重组蛋白抗病毒活性

在重组鸭IFN-α样品进行500-4 000倍稀释的细胞孔中均未见细胞病变，而稀释倍数为8 000的细胞孔中有一半细胞孔出现了细胞病变，因此其抗病毒活性（U/mL）=1 U×抑制50%细胞病变的样品的干扰素稀释倍数/加入干扰素的体积（mL）= 1 U×8 000/0.1 mL=8×104U/mL。这表明表达的重组鸭IFN-α具有较好的抗病毒活性。

图3 表达重组蛋白的纯化

2.6 荧光定量PCR方法检测 IFN-α重组蛋白抗病毒活性

应用荧光定量PCR方法检测了各组不同时间点NDV的含量。结果（图4）显示，在接种NDV的12 h内，添加重组鸭IFN-α的保护组的病毒拷贝数和病毒接种组之间相比基本保持一致，两组的差异并不显著（P＞0.05）。在24 h出现变化，两组的病毒拷贝数都有增加，但保护组的病毒拷贝数的增加数量明显低于病毒接种组，两组差异显著（P＜0.05）；在48 h两组的病毒拷贝数仍在增加，特别是病毒接种组的病毒拷贝数的数量级达107，相比而言保护组的病毒拷贝数增加不多，两组数据差异显著（P＜0.05），在该时间点相对抑制率为91.0%而正常细胞组在各个时间点取样未检测到病毒核酸。

图4 NDV拷贝数动态变化的分析

病毒的滴度也呈现了相似的变化趋势，12 h以内两组病毒的滴度差异不大（P＞0.05），24-48 h两组病毒的滴度差异比较明显（P＜0.05），具体见表2。在48 h，病毒接种组细胞出现部分圆缩、坏死和脱落等细胞病变，而保护组的细胞基本维持正常形态，未见明显的细胞病变。这都表明表达的重组鸭IFN-α具有良好的抗病毒活性。

表2 NDV病毒滴度（TCID50）动态变化的分析

3 讨论

原核系统表达的干扰素的表达量较高，但多以包涵体形式存在，需要经过复性才能获得其生物活性。包涵体的复性是个费时、费力的过程，而且复性后的蛋白其生物活性通常不高。因此，选择合适的原核表达载体、优化表达条件来提高IFN-α的可溶性表达尤为重要。本研究中选择了pET-32a（+）这一高效表达载体，它能快速、高效和稳定地表达基因产物，成本低廉，适合应用于工业化批量生产。该载体表达的目的片段前融合有硫氧还蛋白，它有助于蛋白的折叠，提高可溶性蛋白的含量［10］。此外，研究中使用变温诱导表达的方法，即在加入IPTG后使用相对较低的温度（25℃）进行诱导表达，降低了表达产物形成包涵体的几率，结果表明目前蛋白绝大部分在处理细胞的上清中以可溶形式表达。这些都为重组鸭IFN-α的发酵生产奠定了良好基础。

在干扰素生物活性的检测方法中最经典的就是应用vsv/wish细胞系统通过细胞病变抑制试验方法来测定干扰素的抗病毒活性［11］。该方法需要滴定每个孔病毒的滴度，十分费时费力。此外，干扰素与其受体细胞间的结合具有种属特异性［12］，因此评价不同的干扰素要选择不同的指示细胞，这也影响了评价系统的准确性。为了更好地测定表达的重组鸭IFN-α的生物活性，本研究在初步应用经典试验方法的基础上，应用荧光定量PCR的方法检测了IFN-α重组蛋白体外抗病毒的效果，不仅直观地反映干扰素对病毒复制的抑制效果，同时还能实时对病毒复制的抑制过程进行观察。

细胞病变抑制试验方法来测定重组鸭IFN-α的抗病毒活性约为8×104U/mL，明显高于一些研究中经过包涵体复性的重组鸭IFN-α［8，13］。荧光定量PCR方法检测重组鸭IFN-α的抗病毒活，从24-48 h

这段时间里，保护组由于表达的重组鸭IFN-α的作用，NDV在DEF上的复制受到了明显的抑制，相对抑制率高达91%，各组病毒滴度的动态变化结果也进一步验证了重组鸭IFN-α能有效抑制NDV的复制和增殖。这些都表明，本研究中所表达的重组鸭IFN-α具有良好的抗病毒活性，为今后的大规模的临床应用奠定了基础。

4 结论

本研究利用pET-32a原核表达系统，采用变温诱导的方法成功表达了可溶性的重组鸭IFN-α，经细胞病变抑制法和荧光定量PCR的方法检测，表达的重组鸭IFN-α具有良好抗病毒活性。

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（责任编辑 李楠）

Soluble Expression and Activity Analysis of Mallard IFN-α

Liu Lanlan1Zhuang Yanna2Yu Xiaohong1Zeng Xiangwei2
（1. College of Basic Medical Science，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040；2. College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin 150040）

In order to acquire efficient expression and production of biologically active duck IFN-α, the mature protein gene of duck IFN-α was amplified from pMD18T-MaIFN-α. The fragment was linked to the prokaryotic expression vector pET-32a to construct the recombinant expression plasmids pET-32a（+）-MaIFN-α, and then converted into E.coli BL21 cells. The fusion protein was induced to express in the change temperature condition. SDS-PAGE and western blotting analysis were used to examine the fusion protein. After purified by Ni2+resin column, the activity of the expression product was determined. The results showed that the recombinant pET-32a（+）-MaIFN-α expressed a soluble protein after being induced by IPTG. Western blotting analysis showed the fusion protein had expected antigenicity. The activity of the expressed duck IFN-α detected by inhibiting cytopathic effect was about 8×104U/mL. The activity detected by the Real-time PCR showed that the expressed duck IFN-α had a strong inhibition of NDV replication in DEF. This indicated that the expressed duck IFN-α was verified to be of high antiviral activity.

Mallard IFN-α Soluble expression Activity analysis

2014-05-19

黑龙江省自然科学基金项目（C201223），黑龙江中医药大学校科研基金项目（BS201402）

刘澜澜，女，博士，讲师，研究方向：微生物与免疫；E-mail：lanlan0112@126.com

曾祥伟，男，博士，副教授，研究方向：病毒与免疫；E-mail：xiangwei_zeng@163.com