罗非鱼免疫学研究进展

甘桢王蓓鲁义善汤菊芬简纪常吴灶和

（1.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088；3.仲恺农业工程学院，广州 510225）

罗非鱼免疫学研究进展

甘桢1，2王蓓1，2鲁义善1，2汤菊芬1，2简纪常1，2吴灶和2，3

（1.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088；3.仲恺农业工程学院，广州 510225）

罗非鱼是我国主要的养殖鱼类之一，近年来频繁爆发的罗非鱼病害给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失。鉴于免疫防治技术在水环境保护、食品安全等方面的优势，探讨鱼体免疫系统特性和免疫应答机制逐渐成为学术界的热点。就罗非鱼的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫等方面的研究成果作一综述，旨在为今后深入研究罗非鱼病害的免疫防治技术提供一些可行的思路和有效的依据。

罗非鱼 非特异性免疫 体液免疫 细胞免疫

近年来，随着养殖水体的恶化和养殖密度的提高，水产动物病害频繁发生，给养殖业造成了极大的经济损失，病害的发生已成为整个水产养殖业发展的一大制约因素。一般来说，疾病的发生是在病原、宿主和环境的相互作用下产生的，其中宿主的免疫反应能影响病原的侵染和繁殖，对疾病的进程起到了关键的限制作用，因此鱼类免疫学的研究能为渔用疫苗、免疫佐剂和药物的开发奠定关键的理论基础，是水产动物病害领域的热点学科之一。此外，鱼类作为较为低等的脊椎动物，是脊椎动物免疫系统进化过程中的重要一环，对于鱼类免疫学的研究有利于人们了解脊椎动物免疫系统的起源与进化趋势，具有非常重要的理论意义。

罗非鱼（Oreochromis spp.）具有生长快、繁殖力高、食性广和抗病力强等特点，适合于集约化养殖，并且罗非鱼产品价格适中，深受广大消费者的青睐，是联合国粮农组织（FAQ）推荐养殖的优质鱼类。我国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国和出口贸易国，罗非鱼产业对于我国乃至世界的粮食供应和促进我国的国际贸易都有着十分重要的意义。然而，近几年来，罗非鱼病害频发，给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失。例如，2009年广东、海南等地养

殖罗非鱼的链球菌病发病率达20%-50%，死亡率达50%-70%［1］，病害的发生严重阻碍了罗非鱼产业的健康发展。对于罗非鱼病害的防治，目前大多采用以抗生素为主的药物治疗手段，传统的药物治疗虽然具有一定的治疗效果，但却由于其潜在的环境污染问题和食品安全问题而饱受诟病。因此，探讨罗非鱼病原的致病机理和鱼体的免疫机制，并以此为理论基础，采用免疫防治技术控制罗非鱼病害，将会是未来罗非鱼病害防治的发展方向。本文综述近年来罗非鱼免疫学的相关研究成果，旨在为今后深入研究罗非鱼病害的免疫防治技术提供一些可行的思路和有效的依据。

1 罗非鱼的非特异性免疫

1.1 非特异性免疫细胞

鱼类的非特异性免疫细胞主要包括非特异性细胞毒性细胞（Nonspecific cytotoxic cell，NCC）和吞噬细胞（Phagocyte），其中非特异性细胞毒性细胞是哺乳动物自然杀伤细胞在硬骨鱼类中的进化前体，在鱼体早期抗肿瘤和免疫监视中具有重要作用，而吞噬细胞包括巨噬细胞（Macrophage）、粒细胞（Granulocyte）和单核细胞（Monocyte）等，可对入侵体内的病原产生快速的免疫应答。

罗非鱼的非特异性细胞毒性细胞主要分布于头肾和脾脏，激活后可组成型表达肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），通过TNF-α与膜表面受体TNFR-1结合而发挥其细胞毒性作用，对癌细胞、病毒感染细胞都有极强的清除功能，其细胞毒性虽然是非特异性的，可其作用对象却是有选择性的，可识别和杀伤细胞系HL-60、U937、K562、IM-9和NC-37，而YAC-1对其作用不敏感［2］。罗非鱼血清中的多种细胞因子可激活NCC的细胞毒性，在这个过程中NCC的细胞数量并没有增加，增加的只是单个NCC的细胞毒性［3］。一些非特异性免疫因子可调控罗非鱼NCC的细胞凋亡，如肿瘤坏死因子α可抑制NCC的细胞凋亡，而细胞凋亡敏感性（Cellular apoptosis susceptibility，CAS）基因的表达则可激活NCC的细胞凋亡［4，5］。Ⅰ型非特异性细胞毒性细胞受体蛋白（Non-specific cytotoxic cell receptor protein -1，NCCRP-1）是一种在NCC活化过程起到关键作用的受体蛋白，它既是靶细胞溶解过程的抗原识别分子，又是NCC释放细胞因子的启动者。Ishimoto等［6］利用CpG回文序列刺激罗非鱼的头肾细胞，成功克隆了罗非鱼NCCRP-1的cDNA序列，半定量分析结果显示NCCRP-1在肝脏、头肾和脾脏表达量较高，这与NCC的器官分布具有一致性。而原位杂交的结果则表明，NCCRP-1的转录在淋巴细胞以及中性粒细胞中都有发生，说明其可能在罗非鱼的非特异性免疫应答中发挥着重要的作用。

鱼类细胞培养技术是研究鱼类免疫机制的一项重要手段，尽管相对于高等脊椎动物细胞培养起步较晚，但国内外学者已经相继构建出280余株不同的鱼类细胞系。虽然罗非鱼的细胞系目前还没有被成功构建，但已有学者初步探索罗非鱼非特异性免疫细胞的培养条件，如王秋华［7］发现19-25℃是罗非鱼巨噬细胞的最适培养温度，而注射角鲨烯后48-72 h则是分离巨噬细胞的最佳时期，所培养出的罗非鱼巨噬细胞具有与哺乳动物巨噬细胞类似的特征，如形态不规则、核浆比值低、贴壁生长及可形成多核巨大细胞等。

1.2 非特异性免疫因子

鱼类是兼有特异性免疫和非特异性免疫的脊椎动物，但与高等哺乳动物相比，鱼类特异性免疫机制还不完善，在抵御病原体时主要依赖非特异性免疫的作用，而非特异性免疫因子是鱼类非特异性免疫的主要承担者。鱼类非特异性免疫因子包括主要组织相容性复合物、抗菌肽、溶菌酶、凝集素、补体、干扰素、转铁蛋白和趋化因子等，在罗非鱼中对这些免疫因子有着广泛而较为深入的研究。

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）是参与免疫细胞发育、抗原提呈识别以及免疫应答的关键组分。罗非鱼MHC IIA基因由4个外显子和3个内含子组成，序列存在丰富的多态性，且主要集中在α-1区，表达分析结果显示其在脾脏、肾脏、肠、鳃、性腺、肝脏和心脏表达量都很高；MHC IIB基因由6个外显子和5个内含子组成，这不同于其他硬骨鱼类MHC IIB所具有的5个外显子、4个内含子的结构，表达分析结果显示其在胃和鳃的表达水平较高。此外，MHC IIA和IIB

还可作为两个参与抵御链球菌的候选免疫分子，因为在腹腔注射无乳链球菌后，二者在鳃、肾脏、肠和脾脏这几个主要的免疫器官中都出现了明显的上调表达［8，9］。在哺乳动物中，MHC II和T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）的相互作用提供了T细胞活化所必需的第一信号，这种机制在罗非鱼中是否具有保守性，还有待进一步验证。

Hepcidin是一种在肝脏特异表达的抗菌肽，在抵抗病原感染中起到了重要的作用，也是抗菌肽研究中的一个热点，近年来有不少关于罗非鱼Hepcidin的研究成果。Huang等［10］通过噬菌体文库杂交的方法，得到了3种莫桑比克罗非鱼Hepcidin（分别命名为TH1-5、TH2-2和TH2-3）的cDNA序列，并化学合成了这3种Hepcidin的成熟肽；对由cDNA序列所推导出的氨基酸序列进行进化分析，发现罗非鱼的TH1-5类似于海狸的Hepcidin，TH2-2类似于牙鲆的JF1，TH2-3类似于牙鲆的JF2；而抗菌试验则证明TH1-5和TH2-3具有广谱的抗菌活性，而TH2-2则不具有抗菌活性。在此研究基础上，该团队又分别针对TH1-5和TH2-3进行了一系列深入研究，结果表明，TH1-5和TH2-3对免疫相关基因都具有调节作用，TH1-5具有抗菌（创伤弧菌和无乳链球菌）和抗病毒（传染性胰腺坏死病毒和日本脑炎病毒）［11-13］的功能，TH2-3则具有抗菌（创伤弧菌）［14，15］的功能。而文雅等［16］对TH1-5的成熟肽（mTH）进行了重组DNA表达发现，重组mTH对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌仍具有抑菌活性。除了Hepcidin，Acosta等［17］根据已报道的EST序列，从罗非鱼鳃中分离出了3种抗菌肽转录本，并化学合成了这3种转录本所转录出的多肽，分别命名为Oreoch-1、Oreoch-2和Oreoch-3，抗菌试验的结果显示，这3种化学合成的多肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌都表现出广谱的抗菌活性。以上研究结果表明，罗非鱼抗菌肽具有发展成新型渔用疫苗免疫佐剂的潜力，在未来罗非鱼的病害控制有望发挥重要作用。

罗非鱼的其他一些非特异性免疫因子，如白细胞介素、转铁蛋白、凝集素和溶菌酶等，也有关于对其基因克隆、表达和功能分析的报道。白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）是一种具有多种功能的非特异性免疫因子，在皮肤炎症反应过程中与免疫相关基因的表达有着密切联系，Lee等［18］对尼罗罗非鱼IL-1β的表达特征进行了分析，结果发现在注射LPS后，IL-1β的表达量在1 d后就达到最高值，在3 d后表达量降低，在刺激7 d后，几乎不能再检测到IL-1β的表达，这说明罗非鱼IL-1β可能在黏膜免疫应答的起始阶段起到了重要作用。转铁蛋白（Transferrin，TRF）是一种参与非特异性免疫调控的铁结合蛋白，Rengmark等［19］对尼罗罗非鱼转铁蛋白的功能进行了研究，发现转铁蛋白在罗非鱼暴露于咸水时会出现上调表达，这表明转铁蛋白与其耐盐性密切相关。凝集素（Lectin）是一种与细胞识别和非特异性免疫等多种生物学功能相关的糖蛋白，Argayosa等［20］通过亲和层析从尼罗罗非鱼血清中分离得到了一种L-岩藻糖结合凝集素，称为TFBP，TFBP具有主动结合钙的特性，纯化的TFBP可与人类O型红细胞发生凝集，而不能与A型和B型红细胞发生凝集，且活的嗜水气单胞菌和粪肠球菌细胞也能与此凝集素发生凝集，表明TFBP可能参与罗非鱼对病原菌的识别。溶菌酶（Lysozyme）是非特异性免疫中应对细菌感染的关键酶之一，能直接溶解革兰氏阳性菌最外层的肽聚糖，并能协同阳离子抗菌肽渗入革兰氏阴性菌外膜使肽聚糖暴露于外，禹绍国等［21］克隆了奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因C-1、C-2和C-3，这3个基因均具有其他物种C型溶菌酶的保守结构特征，即8个保守Cys残基和2个活性位点Glu35和Asp52，但其氨基酸序列存在着一定的差异，而这3种溶菌酶在生理功能上的差异与分工还有待在抗菌试验中进行进一步的研究。尽管对罗非鱼非特异性免疫因子的研究较为深入，可对于某些在非特异性免疫中发挥关键作用的免疫因子，如补体和干扰素，相关的研究还比较缺乏，特别是罗非鱼干扰素系统在抗病毒和抗胞内细菌感染中是如何发挥作用的，还有待进一步的探索。

2 罗非鱼的体液免疫

体液免疫主要依赖效应B细胞分泌的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）消灭入侵机体的病原。迄今为止，一般认为鱼类存在3类主要的免疫球蛋白，分别为IgM、IgD和IgT（或IgZ）。IgM是所有脊椎

动物共有的一种免疫球蛋白，被认为是鱼类最主要的Ig分子，是鱼类抵御外界感染的主力军；IgD则主要在成熟B细胞表达，使之成为IgM+/IgD+双阳性细胞，在哺乳类B细胞分化过程中起免疫调节的作用，而在鱼类中可能与清除病原的免疫反应有关［22］；而IgT则被证明可能类似于哺乳动物中的IgA，在鱼类黏膜免疫中起到了重要作用［23］。

对罗非鱼体液免疫的研究主要集中在对罗非鱼IgM的研究上。罗非鱼IgM重链、轻链的分子量分别在80、30 kD左右［24］，与其他硬骨鱼类的IgM分子量相近；鱼类IgM以两种形式存在：一是存在于血液和其他体液中的分泌型IgM（sIgM）；二是存在于细胞表面作为抗原结合受体存在的膜结合型IgM（mIgM）。在罗非鱼中发现的sIgM基因的基本结构形式为Leader-VH-JH-CH1-CH2-CH3-CH4，包含一个多变区（VH）、一个连接区段（JH）和4个典型的恒定区（CH），几乎每个恒定区都含有一个与二硫键连接的半胱氨酸和一个稳定三级结构的色氨酸［25］。Takemura等［26］通过使用ELISA对IgM在罗非鱼仔鱼发育过程的变化进行检测，结果表明仔鱼的大部分IgM是母体起源，亲鱼的IgM会从卵巢转移到卵黄中，并在仔鱼后期由卵黄传递到仔鱼的循环系统；母源IgM在卵细胞中可能发挥两种作用，卵膜中的IgM能起卵细胞免疫屏障的作用，而卵黄中的IgM主要是传递到胚胎和仔鱼体内发挥保护作用。Dominguez等［27］检测了各种环境因子对罗非鱼血浆中的IgM的影响，结果表明在18.4、23和28℃的饲养温度下，IgM浓度随水温的增加而增加，而33℃的饲养温度将导致IgM浓度的降低，这表明对于IgM的生成具有一定的温度范围；在盐度为12和24 ppt时，血浆的IgM浓度显著增加，而在暴露于酸化（pH值4.0）和悬浮物（20、200和2 000 mg/L）的条件下血浆IgM浓度则没有变化。

目前在罗非鱼中只发现了IgM，关于罗非鱼IgD、IgT（或IgZ）国内外还未见相关报道，而且三者的组织定位、相互关系以及在病原入侵时的表达变化和功能还不是很清楚，这也是罗非鱼体液免疫研究中一些亟待解决的问题。

3 罗非鱼的细胞免疫

机体的细胞免疫应答主要是在T细胞的介导下完成的。近年来，在鱼类中相继发现一些参与T细胞活化的关键分子，如TCR、CD3、CD4及CD8等（表1），说明鱼类可能具有类似于高等脊椎动物的T细胞应答过程。

表1 硬骨鱼类中的T细胞相关分子

T细胞活化需要两组信号，T细胞抗原受体（TCR）特异性识别抗原提呈细胞（APC）所提呈的肽-MHC复合物（p-MHC）将提供T细胞活化所需的第一信号，单独存在第一信号不足以激活T细胞，还需要T细胞上的共刺激受体与APC上对应配体结合，向T细胞提供第二信号，也称为共刺激信号，若仅有第一信号而缺乏第二信号，将会导致T细胞失能［57］。一些为T细胞活化提供第一信号的相关

分子已经在罗非鱼中被发现，也初步探讨了这些分子的表达模式以及对病原的应答反应。Nithikulworawong等［36］克隆了尼罗罗非鱼TCRβ的cDNA序列，并通过qRT-PCR发现TCRβ在胸腺的表达水平最高，胸腺是鱼类产生T细胞的主要器官，这说明罗非鱼TCRβ可能具有与高等脊椎动物同源物类似的功能，即能为T细胞活化提供第一信号，特别让人感兴趣的是，无乳链球菌能显著诱导TCRβ的上调表达，这可能与链球菌感染激发了罗非鱼的细胞免疫有关。刘冬［40］克隆尼罗罗非鱼T细胞特异性分化抗原CD3γ/δ、CD4和CD8α发现，三者都具有哺乳动物直系同源物的一些典型结构特征：CD3γ/δ具有保守的CxxCxE基序和免疫受体活化基序ITAM，CD4则具有对T细胞活化起到关键作用的CxC基序，而在CD8α的胞外区和胞内区则存在与维持其空间结构起到密切相关的5个半胱氨酸；表达模式分析结果则表明CD3γ/δ、CD4和CD8α在头肾、脾脏和鳃等免疫相关组织的表达量相对较高。

关于为T细胞活化提供第二信号的共信号分子，在罗非鱼中还未被发现，在硬骨鱼类中国内外学者也只对虹鳟［51，53］、半滑舌鳎［52］和红鳍东方鲀［54］中的少数几个共信号分子（CD28、CTLA-4和CD80/ CD86）进行了初步的研究。在哺乳动物中已经发现的其他共信号分子，如ICOS、LFA-1和ICAM-1等，在鱼类中是否存在，是否像哺乳动物同源物一样对T细胞活化起到类似的作用，还有待进一步研究。

4 展望

近年来链球菌病的频发给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失，链球菌病的防治也成为了罗非鱼病害研究的一个重点和难点。目前，国内外对罗非鱼链球菌病的研究主要包括病原的分子流行病学［58］、全菌疫苗的研发［59］等，这些工作对链球菌病的防治起到了积极的作用，但是离我们全面控制链球菌病发生的目标还相差甚远。链球菌可以在宿主巨噬细胞内增殖，逃避抗生素对其的杀灭作用［60］，这是抗生素类药物对链球菌病治疗效果不佳的主要原因，因此要想开发出有效防治罗非鱼链球菌病的药物和疫苗，十分关键的一点是该药物和疫苗是否能激发罗非鱼T细胞介导的细胞免疫。

鱼类体液免疫机理已经得到了较深入的阐释，在此理论基础上研制的渔用疫苗都能较好地刺激鱼体产生高滴度的特异性抗体，然而，至今仍然存在的科学问题是：渔用疫苗激发的细胞免疫一般比较弱。根据上述分析，关于罗非鱼非特异性免疫的研究较为深入，而细胞免疫的相关研究却相对薄弱，因此加强对罗非鱼细胞免疫的研究，既能填补罗非鱼免疫学研究的薄弱之处，又能为研制防治罗非鱼链球菌病的药物和疫苗提供关键的理论依据。可以从以下3个方面来研究罗非鱼的细胞免疫：一是克隆与罗非鱼T细胞活化、增殖和分化相关的基因，分析上述基因在病原感染或免疫刺激下的时序表达差异，特别值得关注的一点是研究某些基因在细胞免疫和体液免疫的双重调节作用，这将有利于阐述细胞免疫和体液免疫的相互关联；二是表达纯化上述基因的蛋白，制备对应的单克隆抗体，并利用酵母双杂交和免疫共沉淀等技术分析T细胞免疫相关因子之间的蛋白相互作用；三是构建罗非鱼淋巴细胞的细胞系，以此为基础，在细胞水平上研究上述基因对T细胞活化、增殖和分化的影响，阐明罗非鱼T细胞免疫应答的细胞信号通路。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on Tilapia Immunology

Gan Zhen1，2Wang Bei1，2Lu Yishan1，2Tang Jufen1，2Jian Jichang1，2Wu Zaohe2，3
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Guangdong Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Tilapia is one of the major fishes farmed in China. In recent years, outbreak of diseases caused great economic losses in tilapia aquaculture industry. It’s generally believed that immunoprophylaxis and immunotherapy have great advantages in water environmental protection and food safety management, so the research about exploring characteristics of immune system and mechanisms of immune response in fish gradually become a hot issue in academic circles. In this review, the non-specific immunity, humoral immunity and cell-mediated immunity of tilapia were discussed in order to provide useful data for further research on immunoprophylaxis and immunotherapy for diseases of tilapia.

Tilapia Non-specific immunity Humoral immunity Cell-mediated immunity

2014-03-12

国家自然科学基金项目（31302226），广东省科技计划（2012B020308010，2012B020308009），广东省教育厅育苗项目（B12123），2012年广东省鱼病防治专项资金

甘桢，男，硕士研究生，研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制；E-mail：ganzhen258@163.com

鲁义善，男，博士，教授，研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制；E-mail：fishdis@163.com