拳参黄酮与VC、芦丁协同抗氧化作用研究

刘军军，刘金兰，李 帅，安红钢，吴冬青

（河西学院化学化工学院甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000）

拳参（Polygonum bistorta L.）别名紫参、倒根草、地虾，为蓼科属（Polygonaceae）植物拳参的根茎，其味苦涩，性微寒，具有清热解毒、止泻、镇惊息风、消肿止血之功效，用于赤痢、热泻、肺热咳嗽、痈肿、瘰疬、口舌生疮、吐血、痔疮出血、毒蛇咬伤等病症［1］，主要分布于河南、吉林、山东、辽宁、四川、甘肃等地。近年有文献报道从拳参中分离得到没食子酸、树胶、树脂、酚酸等活性成分，并对拳参黄酮进行了纯化和抗氧化性研究［2－5］。

不同药物复配后可产生相加性、协同性或拮抗性等相互作用。目前研究复配效应的方法有等辐射分析法、分数分析法、概率分析法和响应曲面分析法等［6］。其中等辐射分析法是近年来国内外常用于判断药物之间相互作用的方法，能够简便、精确地对药物之间的相互作用进行定性、定量分析［7－8］。有研究表明，复合抗氧化剂的抗氧化活性高于单个组分在添加浓度下的活性之和，即表明组分之间存在协同抗氧化作用［9］，可使产品更高效、更经济、更具安全性，且抗氧化性能得到改善［10］。作者在此采用Isobologram分析和清除·DPPH法相结合的方法对拳参黄酮与VC、芦丁的协同抗氧化作用进行了考察，以期为拳参的进一步开发利用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

拳参，2013年采自甘肃陇西。

芦丁（生化试剂，批号F20040304），医药集团上海化学试剂公司；·DPPH（生化试剂，批号1898－66－4），梯希爱化成工业发展有限公司；抗坏血酸（VC）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等均为分析纯。

WFJ－2100型可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；RE－2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH－4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拳参黄酮溶液的制备

取拳参干燥药材粉碎，过50目筛，以料液比1∶10（g∶mL）加入60%乙醇，在40℃下超声提取1h，抽滤，滤液浓缩，转入100mL容量瓶中用60%乙醇定容，冷藏备用。

1.2.2 拳参黄酮质量浓度的测定［11］

1）标准曲线的绘制：准确称取已烘干至恒质量的芦丁0.0235g，用60%乙醇溶解并定容至100mL，得0.2350mg·mL－1的芦丁标准溶液。准确移取1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL芦丁标准溶液于25mL容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液1.00mL，摇匀，静置6min；加入10% Al（NO3）3溶液1.00mL，摇匀，静置6min；加入5% NaOH溶液10.00mL，用60%乙醇定容，摇匀，静置15min后，在500nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度（c）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到回归方程：A＝11.079c－0.029，R2＝0.9999，线性范围为0.0094～0.0564mg·mL－1。

2）移取0.10mL拳参黄酮溶液于25mL容量瓶中，按照上述方法测定吸光度，根据回归方程计算拳参黄酮质量浓度。

1.2.3 拳参黄酮清除·DPPH能力测定［12］

移取不同浓度的拳参黄酮溶液1.00mL，用50%乙醇补加至4.00mL，再加0.1mg·mL－1的·DPPH溶液1.00mL，摇匀，静置，室温避光反应30min，然后于517nm波长处测定吸光度A1；空白组以等体积无水乙醇代替·DPPH溶液，测定吸光度A2；对照组以等体积50%乙醇代替样品溶液，测定吸光度A0；以VC、芦丁为阳性对照组。按式（1）计算拳参黄酮对·DPPH的清除率：

1.2.4 Isobologram分析法研究拳参黄酮与VC、芦丁的相互作用［13］

根据VC、芦丁、拳参黄酮单独作用时的IC50值，选择拳参黄酮与VC、芦丁的比例（质量浓度比，下同），将拳参黄酮与VC或芦丁按上述比例混合后，按1.2.3方法测定复合抗氧化剂对·DPPH的清除能力，计算清除率和IC50mix值。

1.2.5 统计学分析［13］

对药物之间相互作用关系进行统计学分析。按式（2）计算IC50add：

式中：IC50add、IC50a分别为理论复配组、a药单独作用时的IC50值；Pa、Pb分别为a、b在复配组中所占的比例；R为a、b两种抗氧化剂单独使用时的效价比，即R＝IC50a／IC50b。

由实验得到复配组实际的IC50mix值，对IC50add和IC50mix进行显著性比较：如果IC50add显著小于IC50mix，表明药物之间具有拮抗作用；如果IC50add显著大于IC50mix，表明药物之间具有协同作用；如果IC50add与IC50mix无显著差异，表明两者具有相加作用。无论是协同作用还是相加作用，两者都可以有效指导人们在用药时减少药物的浪费，充分利用各自优点取长补短。

进一步按式（3）计算相互作用指数（γ），以评价协同、相加或拮抗作用的程度：若γ＝1，表示两者之间为相加作用；γ＞1，表示拮抗作用，且γ值越大拮抗作用越强；γ＜1，表示协同作用，且γ值越小协同作用越强（置信度P＝0.95）。

2 结果与讨论

2.1 拳参黄酮的质量浓度

进行5组平行实验，测得提取溶液中拳参黄酮质量浓度为4.095mg·mL－1，RSD为1.364%。

2.2 拳参黄酮对·DPPH的清除能力

·DPPH是一种人工合成的单电子、以氮为中心的化合物，向其中加入抗氧化成分时，·DPPH接受1个电子，溶液紫色变浅，且褪色程度与抗氧化剂质量浓度呈线性关系［14－15］。测定拳参黄酮、VC、芦丁对·DPPH的清除能力，结果见图1和表1。

图1 拳参黄酮、VC和芦丁清除·DPPH能力Fig.1 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

表1 拳参黄酮、VC、芦丁清除·DPPH的IC50值Tab.1 IC50Values of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

由图1可知，随着样品质量浓度的增大，三种溶液对·DPPH的清除率均呈上升趋势，在实验范围内，拳参黄酮对·DPPH的清除作用强于芦丁、弱于VC。

由表1可知，清除·DPPH能力大小依次为：VC＞拳参黄酮＞芦丁，说明拳参黄酮具有较强的抗氧化能力。

2.3 Isobologram分析法评价拳参黄酮与VC、芦丁协同抗氧化能力

2.3.1 拳参黄酮与VC、芦丁复配清除·DPPH能力

基于拳参黄酮与VC、芦丁的IC50比值分别为1∶1.54、1∶0.77，选择拳参黄酮与VC或芦丁的比例为3∶1、1∶1、1∶3，每组的质量浓度范围为0.005000～0.035000mg·mL－1。按照上述比例混合后，按1.2.3方法测定复合抗氧化剂对·DPPH的清除率并计算其IC50mix，结果见表2和表3。

表2 拳参黄酮与VC、芦丁复配清除·DPPH的能力Tab.2 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin

由表2可知，随着复合抗氧化剂浓度的增大，清除·DPPH的能力逐渐增强，复合抗氧化剂达到一定浓度后清除率基本保持不变。

由表3可知，拳参黄酮分别与VC、芦丁复配后的IC50mix值大小均为3∶1＜1∶1＜1∶3，表明拳参黄酮与VC、芦丁的质量浓度比为3∶1时复配抗氧化效果最佳。

2.3.2 拳参黄酮与VC、芦丁复配后的Isobologram分析

表3 拳参黄酮与VC、芦丁复配清除·DPPH的IC50mix值和γ值Tab.3 IC50mixandγValues of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin against·DPPH

将实验所得VC、芦丁的IC50值及95%可信线标绘于横坐标，拳参黄酮的IC50值及95%可信线标绘于纵坐标，将IC50值连接成相加线，绘制95%置信区，并绘入复配体系的IC50值，结果见图2。若复配体系的效应点落在相加线及95%置信区内，表示两药为相加作用；若落在相加线左侧，表示两药为协同作用；若落在右侧，则表示两药为拮抗作用。

由图2可知，拳参黄酮与VC、芦丁复配后的效应点均在相加线及置信区左侧，说明两药之间均存在协同抗氧化作用。

2.3.3 统计学分析

拳参黄酮与VC、芦丁复配体系的IC50add值、IC50mix值和相互作用指数γ见表3。

由表3可知，两组复配体系的IC50mix都显著小于IC50add，两者之间存在着差异，γ值都小于1，进一步说明拳参黄酮与VC、芦丁以不同比例复配之后，其抗氧化能力均比它们单独作用时强，相互间存在良好的协同抗氧化作用，尤其是拳参黄酮与VC、芦丁质量浓度比为3∶1时，协同抗氧化作用最好。由于拳参黄酮与VC复配体系的IC50mix均小于拳参黄酮与芦丁复配体系的IC50mix，因此，拳参黄酮与VC复配体系的协同抗氧化作用强于拳参黄酮与芦丁复配体系。

3 结论

拳参黄酮与VC、芦丁以不同比例复配后有明显的协同抗氧化作用，比任一单独使用效果更好。当拳参黄酮与VC、芦丁的质量浓度比为3∶1时，协同抗氧化能力最强，且拳参黄酮与VC的协同抗氧化作用要强于拳参黄酮与芦丁的协同抗氧化作用。

图2 拳参黄酮与VC（a）、芦丁（b）复配后的Isobologram分析图Fig.2 Isobolographic plot of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC（a）or rutin（b）

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