漆酶及未培养微生物中漆酶基因的研究进展

齐 晶，周 赓，卢向阳，田 云

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙410128）

漆酶（对苯二酚氧化酶，EC 1.10.3.2）是一类含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，能利用分子氧作为电子传递介质氧化多种类型的酚类化合物及非酚类化合物，将分子氧还原为水［1－2］，是一种糖蛋白。漆酶因其底物范围很宽而被广泛应用于纸浆漂白［3］、染料脱色［4］、有机物合成［5］、木质素降解［6］等工业及生物技术领域。由于不同应用领域要求不同酶学性质的漆酶，因此通过开发新的漆酶基因资源来获得具有多样性的漆酶意义重大。在自然界中存在着大量无法用传统方法培养的微生物，科研工作者通过构建宏基因组文库，从中筛选漆酶基因，为漆酶的多样性、高效性筛选提供了新的途径。

1 漆酶的作用特点及研究现状

1.1 漆酶的催化氧化特性

漆酶含有4个铜离子，分别存在于3个不同的结合位点上，在漆酶的催化机制中起着关键性作用［7］。漆酶能够利用氧气作为电子受体，氧化多种酚类及芳香族化合物［8］。大部分漆酶以胞外单分子球蛋白的形式存在，分子质量在40～110kDa之间，漆酶分子都存在着不同程度的糖基化［9］。

漆酶的催化氧化作用主要由漆酶的4个铜离子和底物的自由基共同完成。漆酶分子结构中的4个铜离子构成了2个活性中心：T1铜离子结合位点，这个位点与漆酶底物的氧化能力相关联；T2和2个T3铜离子组成三铜离子还原中心结合位点，该位点不仅能接收来自T1位点的电子，还能将氧气还原成水。底物与酶活性中心的T1铜离子位点相结合，底物氧化释放电子，三铜离子还原中心通过His－Cys－His途径转化电子，接着将电子传递给氧分子，将氧分子还原成水［10］。与此同时，漆酶底物形成自由基，底物的自由基自身可以结合也可以相互偶联，从而生成聚合物或偶联产物［11］。漆酶属于单电子氧化还原酶类，在小分子介质存在下，漆酶还能够氧化非酶底物［12］。据初步统计，漆酶的催化底物已达200多种［13］，根据其结构的特异性分为6类：（1）酚类及其衍生物：邻、对苯二酚等；（2）芳胺类及其衍生物：氨基苯、1，5－萘二胺；（3）羧酸及其衍生物：原儿茶酸、香豆酸、对氨基水杨酸；（4）甾体激素和生物色素：雌甾二醇、氧化胆红素；（5）金属有机化合物：二茂铁类化合物；（6）其它非酚类化合物：亚铁氰化钾、抗坏血酸。

1.2 漆酶的研究现状

漆酶作为一种生物酶，具有酶的所有特点，温度、底物、pH值对漆酶的影响非常大。漆酶在生产和应用过程中都有可能失活，影响酶的使用效果。漆酶按来源可以分为植物漆酶、真菌漆酶、细菌漆酶以及动物漆酶等4大类［8］。表1列出了这4类酶的优缺点［8，14－15］。

在这4类漆酶中，以真菌漆酶研究得最为深入。真菌漆酶的研究主要包括以下4方面：（1）对不同产漆酶真菌进行菌种筛选、基因克隆，筛选出高效、产酶量大的菌种，其中白腐真菌产生的漆酶被认为是效果最好的［16］，但真菌漆酶的一些缺点（如热稳定性差、不能用于原核表达系统高效表达等）也限制了其应用范围；（2）对产漆酶真菌菌种进行改造，包括利用物理、化学、生物等方法使菌株发生改变，提高漆酶产量，以及对真菌漆酶的分子结构和空间结构的研究；（3）对产漆酶真菌的发酵条件进行优化，使漆酶产量最大化；（4）真菌漆酶在降解木质素方面的理论研究，以及在造纸、纺织工业等领域的应用。

表1 4类漆酶的优缺点Tab.1 The advantages and disadvantages of the four kinds of laccases

漆酶的催化底物较多，因此具有广阔的应用前景，但天然来源的4类漆酶存在产量低、性质单一、价格昂贵、活性不稳定等不足，难以满足实际需求，漆酶的工业化生产也受到影响。

2 未培养微生物中漆酶基因的研究进展

2.1 未培养微生物及研究手段

未培养微生物（uncultured microorganisms）是指到目前为止人们还无法纯培养的微生物［17］。环境中绝大部分的微生物还没有被人类所认识，其中势必蕴含着巨大的生物资源。无论是未培养微生物的种群结构，还是其功能的特异性、新陈代谢途径等都与纯培养微生物有着不一样的特点，这其中隐藏着大量未知的生物遗传信息［18］。所以开发和利用未培养微生物，并从特定的环境中筛选出某些未知的微生物、克隆获得具有特异性功能的基因是目前微生物资源的研究热点。

因为自然环境中大部分的微生物不能依靠传统的培养方法进行筛选，造成了微生物资源的浪费和丢失，为此科研工作者研发了一种新的方法——宏基因组学（metagenomics）［19］对未培养微生物进行研究。宏基因组的定义为：环境中全部微生物的遗传物质的总和，包括可培养的微生物基因和不可培养的微生物基因。宏基因组技术是：提取特定环境中的总DNA分子，克隆到大肠杆菌等宿主细胞中用来构建宏基因组文库［20］，然后再对宏基因组文库中的克隆子进行功能驱动筛选和序列驱动筛选分析。目前，已经通过构建宏基因组文库筛选得到大量新的基因，如编码纤维素酶［21］、蛋白酶［22］、酯酶［23］、木聚糖酶［24］等活性物质的基因。

2.2 未培养微生物中漆酶基因的研究进展

随着分子生物学和基因组学等技术的发展，漆酶的工业化生产逐渐朝着分子层面进行，如漆酶的异源表达系统的构建。漆酶异源表达是将获得的漆酶基因插入适合的载体中进行高效表达的分子技术。完成漆酶异源表达的前提是必须得到漆酶基因。在漆酶基因的克隆和鉴定方面，现阶段国内外采用的主要方法是：首先从以木质纤维素为食物的昆虫［25－26］或利用木质纤维素转化为自身生长需要的菌类［27］等具有木质素降解能力的环境中分离具有漆酶活性的微生物，接着对获得的菌株进行鉴定，利用分子生物学的方法对漆酶基因进行克隆、鉴定和表达，研究菌株的产漆酶条件和漆酶的酶学特性。

目前，科研工作者从未培养微生物中筛选克隆新的漆酶基因［28］，并将新的漆酶基因构建至表达载体，对其表达产物进行酶学性质分析，丰富了漆酶性质的多样性。Beloqui等［26］从牛瘤胃中构建宏基因组文库筛选得到RF51基因，生物信息学软件分析预测这些序列属于拟杆菌属，将其在大肠杆菌中进行表达，对得到的漆酶进行了酶学性质、铜离子结合位点等的分析；Coy等［29］从白蚁后肠中筛选得到RfLacA、RfLacB基因，通过对其编码的蛋白研究发现，白蚁后肠的漆酶来源于白蚁，在唾液腺产生，分泌到前肠，结合铜离子后，在白蚁肠道中对木质纤维素的降解起作用；Ye等［30］从红树林环境中构建宏基因组文库，筛选获得一段大小为1 500bp的具有碱性漆酶活性的基因，命名为Lac591，Lac591基因与嗜碱芽孢杆菌的漆酶相比同源性为52%，且有4个作为铜离子结合位点的组氨酸保守区域；Fang等［31－32］从中国南海的海洋微生物中通过构建宏基因组文库筛选获得1个在弱碱性条件下有独立活性且对氯化物有极强耐受性的新漆酶基因片段，命名为Lac15，Lac15有439个氨基酸，大小为1 320bp，含有3个保守的Cu2＋结合区域；Fang等［33］从熊猫粪便中构建宏基因组文库筛选得到Lac51基因，该基因编码的漆酶不仅是金属离子的氧化酶，而且很有可能是在宿主细胞胞外起作用的胞外酶，因为Lac51基因的N端有一个TAT型的信号肽。

在牛瘤胃、白蚁后肠、红树林土壤、南海海水、熊猫粪便等未培养微生物中克隆得到漆酶基因的具体研究 情况见表2。

表2 未培养微生物中漆酶基因的研究情况Tab.2 Research status on laccase genes from uncultured microorganisms

以上研究成果说明，通过构建未培养微生物宏基因组文库能克隆到新的高效漆酶基因，未培养微生物是一个巨大的资源库，不仅数量多，而且种类丰富，为漆酶基因筛选的多样性、高效性提供了重要的物质基础。

3 展望

宏基因组技术避开了需要培养的步骤，弥补了传统纯培养微生物技术的不足，为人们调查微生物的群落及其资源、开发利用未培养微生物的多样性、发现新的基因提供了很好的策略［34］。宏基因组技术是一种高效快速获得漆酶基因的方法，丰富了漆酶的来源，拓宽了木质素酶的研究领域，加强了未培养微生物中漆酶的基础和应用研究，在生物质资源研究和综合利用等方面具有重要的意义。

在筛选新型的工业用酶和生物活性物质方面，宏基因组技术具有高效、快速等优势，在未培养微生物的寻找、功能基因筛选、生态学研究等领域有着巨大的应用潜能。

由于漆酶功能的特殊性，今后应进一步加强和完善以下两方面工作：（1）目前对宏基因组文库进行筛选多采用底物丁香醛连氮及愈创木酚，但这两种底物对漆酶反应的效果不是很明显［32］，因此，选择更合适的筛选底物能够大大提高筛选效率；（2）加强漆酶性质与功能方面的研究：造纸工业，主要是利用漆酶对纤维素进行降解，降解机理以及详细的降解过程还有待进一步研究［35］；纺织工业，排放的废水大部分都是高温且呈碱性的，要利用漆酶降解废水中的染料［36］，必须加强漆酶的性质以及漆酶的固定化等方面的研究。

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