基因组转录调控元件分析方法研究进展

李文茂贾东方许嵘，2

（1.华侨大学生物医学学院，泉州 362021；2.泉州医学高等专科学校，泉州 362100）

基因组转录调控元件分析方法研究进展

李文茂1贾东方1许嵘1，2

（1.华侨大学生物医学学院，泉州 362021；2.泉州医学高等专科学校，泉州 362100）

真核生物的基因表达是一个非常复杂的过程，需要多种转录调控元件的协同作用精确调控。全基因组转录调控元件的筛选和鉴定对于基因表达调控机制和生物学功能研究具有重要意义。但转录调控元件的高效筛选及功能验证仍是研究人员面临的主要挑战。结合近年来转录调控元件的研究成果，对基因组中转录调控元件的预测、筛选及功能验证方法做一综述。

转录调控元件 高通量筛选 标志物

诸多生物学功能的实现取决于基因在时间和空间上的特异性表达。真核生物的基因表达调控是一个极其复杂的过程，需要一系列转录调控因子和DNA序列精确地相互作用。参与基因转录调控的DNA序列称之为转录调控元件（Transcriptional regulatory elements，TREs），主要包括启动子、增强子、绝缘子等。据估算，哺乳动物基因组中约有5%的DNA序列含有编码信息，但仅有1.5%的序列能够编码蛋白质［1］。最近的研究表明，许多疾病的发生与转录调控元件的突变相关，因此，这些非编码转录调控元件的筛选及功能探索对基因表达调控机制和生物学功能研究具有重要意义［2］。

如何对基因组中的TRE进行准确预测，将是研究人员面临的一个重大挑战。与固定于基因5'端的启动子不同，一些调控元件在基因组中位置不固定，如增强子，可以通过远程相互作用与远端启动子相互作用，调控基因表达。对于转录调控元件的筛选，传统的方法是通过比较基因组学寻找物种间同源非编码DNA保守序列。近几年，随着基因芯片技术和高通量测序技术的发展，通过检测转录调控元件的相关表观修饰物，可以准确、快捷的对TRE进行分析和定位。本研究对近几年TRE元件的表观标志物研究及筛选方法进行分析、比较、探索，旨在为相关研究提供参考以及思路。

1 转录调控元件指示性表观修饰物

在基因转录调控过程中，除了转录调控元件及

转录调控因子外，还存在许多表观修饰信息影响基因表达调控。这些表观调控信息主要包括：组蛋白修饰、染色质重塑和核小体变形等。组蛋白修饰是其中表观遗传调控最重要的内容。在染色质中组蛋白N末端容易受到修饰酶的甲基化、乙酰化等共价修饰。这种组蛋白修饰往往对基因的表达具有很大影响［3］。不同的TRE元件具有不同的组蛋白修饰模式，且多种组蛋白形成修饰组合协同影响基因的表达。不同的转录调控元件具有不同的表观修饰标志物，根据这些标志物可以对相关调控元件在基因组中的位点进行预测和定位（表1）。

表 1 TRE相关指示标志物

1.1 启动子

研究显示组蛋白3赖氨酸4三甲基化（H3K4-me3）主要分布于启动子转录起始位点（Transcription strartsite，TSS）周围，同时在增强子区域也存在［4］。在对胚胎干细胞（Embryonicstem cell，ES）和分化细胞的染色质H3K4me3修饰研究时发现，H3K4me3广泛存在于所有类型的启动子中，与启动子元件存在线性相关性［5，6］。此外，除H3K4me3修饰外，启动子元件还存在一些其他表观特征，包括组蛋白乙酰化、H3.3组蛋白变体、DNase I超敏性（DNase I hypersensitivity）及Pol II（RNA-polymerase II）聚合酶结合位点等［7-10］。

不同活性的启动子元件，其表观修饰特征也存在一定的差异。一些处于抑制状态的启动子元件也具有独特的染色质修饰特征，如组蛋白3赖氨酸27（H3K27）甲基化、组蛋白3赖氨酸9（H3K9）甲基化等。H3K27三甲基化（H3K27me3）是一种多梳蛋白抑制物，H3K27me3在沉默型启动子中分布水平要比在活跃启动子高得多［11-14］。但研究显示，H3K27me1主要分别在活跃型启动子中［14］。H3K9的甲基化主要参与异染色质的形成和基因表达沉默［15］。研究表明，H3K9双甲基化和三甲基化（H3K9me2 和H3K9me3）主要分布在沉默型启动子的TSS周围，而单甲基化（H3K9me1）却分布于活跃型启动子TSS的周围［14］。

1.2 绝缘子元件

绝缘子是基因组中阻止增强子活性和异染色质延伸的一种DNA元件。在哺乳动物中，转录抑制因子CTCF一种广泛存在于脊椎动物中的锌指蛋白，对绝缘子功能发挥的关键调控因子，且在染色质环状结构的形成和稳定方面具有重要作用［16］。在不同的细胞系中，CTCF（CCCTC-binding factor）结合位点具有相同的序列，因此CTCF具有广泛性，可用于绝缘子元件的筛选［14，17］。

1.3 增强子元件

1.3.1 P300 P300是一种乙酰转移酶，它与某些特异性转录因子，如CREB结合，可以使组蛋白发生乙酰化进而激活基因的转录［18］。Heintzman等［19］利用ChIP-chip方法对人基因组中30 Mb区域进行组蛋白修饰等相关研究时发现，P300结合位点的分布情况与增强子在基因组中的分布模式相吻合，且大部分P300结合位点与DNase I位点和基因序列保守区域相重叠。这些证据表明P300和增强子功能之间可能存在着相关性。Visel等［20］运用ChIP-seq技术在小鼠胚胎组织中进行P300结合位点的进一步筛选，将克隆的DNA片段进行转基因小鼠试验，证实P300结合位点可精确的鉴定出增强子片段。相比于比较基因组学方法，P300结合位点可以明显提高增强子预测的精确度，且可以预测出序列保守性较弱的增强子元件［20，21］。因此，P300是一种有效预测增强子的标志物。

1.3.2 组蛋白修饰和增强子的分类 早期对增强子的组蛋白修饰物主要集中在组蛋白3赖氨酸4单甲基化修饰（H3K4me1）上。基因组范围内的H3K4me1分布模式研究发现，H3K4me1的分布具有高度的细胞特异性，且主要分布于增强子元件区域，可用于增强子元件预测［19，22，23］。但研究显示，单独的H3K4me1修饰并不能有效预测所有增

强子元件，一些H3K4me1片段在报告基因验证中并不具有增强子活性［22］。在对鼠的胚胎干细胞及其他几种分化细胞的全基因组分析发现，另一种组蛋白修饰H3K27乙酰化（H3K27）与增强子功能元件存在很大相关性［24］。Rada等［25］研究发现，在人胚胎干细胞中也发现了这种相关性。相比没有发生H3K27ac修饰的增强子，H3K4me1＋和H3K27ac+增强子片段显然具有更强的基因表达调控活性［24，25］。 在 令H3K27ac-状 态 的 增 强 子 获 得H3K27ac修饰后则显著增强调控基因的表达活性，而增强子元件去H3K27ac修饰或H3K4me1和H3K27ac双修饰后，基因表达活性显著下降。因此，H3K27ac修饰对增强子元件功能具有重要影响。Rada等［25］将H3K4me1＋、H3K27ac＋型增强子归类为活跃型增强子元件，认为这类元件与细胞特异性调控功能相关。而H3K4me1＋、H3K27ac-型增强子可能与细胞分化功能相关，在分化的某个过程中处于静止状态等待激活［25］。

此外，在进一步对增强子相关组蛋白标志物研究时发现，一部分沉默型增强子还含有一种甲基化抑制物（H3K27 me3或H3K9me3）。Zentner等［26］根据H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3修饰及相关基因表达活性，将增强子元件分为3类：（1）H3K4me1+、H3K27ac+活跃型增强子，参与细胞特异性表达调控；（2）H3K4me1+、H3K27ac-活性较弱型增强子，它参与非特异性细胞功能调控；（3）H3K4me1+、H3K27me3+（H3K9me3+）沉默型增强子，该型增强子在发育过程中起作用。

Ernst等［27］还对增强子相关组蛋白标志物进行了进一步的研究，他们对9种细胞全基因组范围进行9种组蛋白修饰物的高通量定位分析发现，活跃型增强子分为两类：一部分增强子含有明显的 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac 和H3K9ac修饰。另一部分则H3K4me1 和 H3K27ac信号很强，但是H3K4me2 和 H3K9ac修饰相对较弱。而对于较弱型和沉默型增强子，H3K4me1的修饰水平较弱。同时，该研究也表明，活跃型增强子与细胞特异性功能调控相关。

以H3K4me1和p300作为单一标志物并不能判断增强子的表达活性，因此对增强子进行类型划分非常有必要。通过组蛋白修饰模式，将增强子进行分类，有助于对增强子类型以及增强子活性的预测和筛选。Ernst等［27］的研究发现H3K27me3+沉默型增强子比其他增强子序列上更保守，这也可能解释了为什么大部分高度保守的序列在报告基因检测中没有活性。

1.4 转录调控元件的染色质核小体变体特征

真核生物核小体由核心组蛋白八聚体和缠绕的DNA及组蛋白H1组成。含有H3变体H3.3和H2A变体H2A.Z的核小体很不稳定，容易在中性盐环境中被破坏。通过这些变体可以改变染色质的空间构象和稳定性，影响基因的转录。染色质中基因转录调控区域普遍认为是一段核小体退化的区域，主要分布在在启动子、增强子、绝缘子等区域［14，25］。

2 转录调控元件筛选方法

2.1 比较基因组学序列保守性分析

比较基因组学方法主要基于这样的理论：基因组中许多功能序列由于净化选择保存下来，而非功能性片段突变对机体的健康的影响微不足道，使得这种突变可以漂移累积。随着物种间进化发生，发挥重要功能的DNA片段比非功能性片段具有很低的突变率而有序列保守性［28］。因此，同源基因间的序列保守性与序列的功能性之间存在一定的线性相关性［29］。通过算法分析出一定进化距离的物种间同源基因的序列保守性，可用于转录调控元件在基因组中分布的预测及定位。已有多种基因组浏览器和软件用于物种间保守非编码序列筛选，如表2。

表 2 常用保守非编码序列预测软件

此外，多个研究组已成功应用这种方法筛选到多种转录调控元件［30-33］。

比较基因组学借助计算机进行算法分析，然后对调控元件进行活性筛选，易于进行。且随着多个

物种基因组测序项目的完成，各物种的基因序列越来越容易获取。因此比较基因组学日益成为调控元件预测和筛选的重要方法。但由于算法等技术限制，基于比较基因组学的方法并不能筛选出所有功能性调控元件。很多功能性元件并没有呈现物种间序列保守性［34，35］。根据DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA elements，ENCODE）项目组公布的信息，现已证实约50%的TRE序列没有显示序列保守性［36］。此外，研究表明一些保守的非编码序列并没有生物学功能［33，37］。因此，单独根据序列保守性筛选功能性调控元件的成功率较低，并不是一种理想的方法，但可作为功能性调控元件筛选的依据。

2.2 高通量筛选实验方法

2.2.1 DNase I超敏性和FAIRE DNase I超敏性常用于分析染色质中的相对开放性区域。转录调控因子结合到DNA序列上需要形成相对开放的染色质构象，使得这些位点对于DNase I的切割具有非常高的敏感性。这些染色体开放区域常是一些DNA调控元件位点，包括启动子、增强子、隔离子、绝缘子等。利用DNase I超敏性结合基因芯片技术（DNase-chip）或深度测序技术（DNase-Seq）可应用于全基因组转录调控元件的筛选和鉴定［38-40］。与DNaseI超敏性不 同，FAIRE（formaldehyde-assisted identification of regulatory elements）方法则是利用甲醛对染色质进行交联，通过超声波对染色质开放区域进行切割［41］。虽然DNase I超敏性和FAIRE不能用于确定具体的TRE类型，但与其他方法相结合可以有效提高TRE的筛选效率。

2.2.2 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP） 染色质免疫共沉淀技术是在活细胞状态下，通过甲醛交联蛋白质和DNA，并将其随机切割成小片段。通过某种转录因子的特异性抗体富集与目的蛋白结合的DNA片段。传统的方法是PCR分析富集的DNA片段，该方法很难实现全基因组范围的高通量研究。Ren等［42］将ChIP技术和基因芯片技术结合（ChIP-chip），实现全基因组范围转录因子的定位和功能分析。近几年来高通量测序技术的发展，结合ChIP技术发展的ChIP-seq技术被广泛用于全基因组转录调控因子的研究。

基于ChIP-chip/seq等高通量方法可以全基因组范围定位转录调控因子的结合位点，因此被广泛应用于转录调控元件的高通量筛选。如通过ChIP-seq技术绘制全基因组转录因子CTCF结合位点，用于筛选绝缘子元件［17］。但ChIP技术需要针对每种转录因子的特异性抗体，理论上若在基因组范围内筛选所有的TRE元件需要制备针对每种转录因子的抗体，这是几乎不可能完成的。但是应用ChIP-chip/seq检测一些TRE标志性表观标志物，可以为这一问题的解决提供光明前景。可以依据ChIP-chip/seq技术检测的相关表观标志物在基因组中的分布对TRE元件进行分析及预测。

3 转录调控元件的功能验证

DNA片段的转录调控活性一般是通过报告基因瞬时转染的方法进行验证。将预测的TRE序列插入到荧光素酶报告基因质粒中，瞬时转染到细胞中，通过检测荧光素酶报告基因的发光强度，对TRE元件的活性进行对比分析；对于启动子活性的检测，是将预测的TRE元件置于报告基因的上游；而增强子活性则是在活性较弱的启动子元件下进行验证，绝缘子元件需要置于增强子和启动子元件之间进行验证。通过报告基因瞬时转染法可以高通量筛选分析TRE元件［43-45］，但这种方法也存在一些缺陷。例如，瞬时转染的质粒不能整合到基因组中，因此DNA片段不能正确呈现出染色质的构象，可能会出现异常表达。其次用于体外培养的细胞不能真实模拟体内环境。

动物模型转基因分析方法可以克服这些缺点，该方法可以通过显微操作将质粒随机整合到受精卵基因组中，通过报告基因在胚胎的表达模式可以检测插入DNA片段的组织特异性和活性。目前已有多种模式动物中应用于转基因分析筛TRE元件［46-48］，Pennacchio等［49］更是通过转基因小鼠分析对人基因组中保守非编码序列进行高通量分析，筛选出75种增强子序列。但是转基因分析对实验室条件要求严苛，且实验成本相比瞬时转染要高，限制了该方法的广泛应用。

4 结语

许多TRE在某种类型细胞或发育的某个阶段

处于沉默状态，在进一步的功能验证中无表达活性。因此，需要有效的手段对相关调控元件基因组中分布位置以及表达活性进行预测分析。比较基因组学、DNaseI 超敏性、FAIRE等方法不具有特异性，不能对TRE的类型进行预测，且不能分析TRE元件的活性状态。通过ChIP-chip/seq可以实现全基因组范围筛选，并可对相关的TRE进一步细分。但目前ChIP-chip/seq的分辨率较低，在基因组中分布范围广，因此很难确定筛选序列的核心区域。但是通过多种方法的综合分析及对比验证，将会大大提高TRE筛选的效率和成功率。

近年来，虽然相关表观修饰物的研究对TRE筛选具有指导意义，但我们对染色质修饰机制及这些修饰对基因的调控机制仍十分缺乏。同时还有许多的新的表观修饰物去发现和归类。因此，随着筛选技术的发展和相关机制的深入研究，基因调控元件将进一步应用于基因治疗等领域的研究中。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Advance in Genome-wide Identification of Transcription Regulatory Elements

Li Wenmao1Jia Dongfang1Xu Rong1，2
（1. School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2. Quanzhou Medical College，Quanzhou 362100）

Expression of eukaryotic genes is a complex process, achieved through the coordinated action of transcription regulatory elements. The screening and identification of transcriptional regulatory elements in genome scale have crucial significance for understanding the mechanism and biological function of gene expression regulation. However, the effectively screening and function verification is still the major challenges for researchers. Herein, based on the latest research findings, we reviewed the methods of prediction, screening, function analysis of transcription regulatory elements in genome.

Transcriptional regulatory element High throughput screening Biomark

2013-12-26

福建省教育厅科技项目（JA12434），泉州市科技计划项目（2012Z71）

李文茂，男，硕士研究生，研究方向：肺癌靶向基因治疗；E-mail：liwenmao@aliyun.com

许嵘，男，博士研究生，讲师，研究方向：基因治疗；E-mail：xurong197886@sina.com