小分子半抗原直接包被ELISA用于虾肉氯霉素检测

赛娜，吴蕴棠，孙忠，乌兰图雅，黄国伟，*

（1.天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070；2.锡林郭勒职业学院信息技术工程系，内蒙古锡林浩特026000）

小分子半抗原直接包被ELISA用于虾肉氯霉素检测

赛娜1，吴蕴棠1，孙忠1，乌兰图雅2，黄国伟1，*

（1.天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070；2.锡林郭勒职业学院信息技术工程系，内蒙古锡林浩特026000）

探讨新型氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法检测食品中氯霉素残留的可行性。采用氨基化氯霉素直接包被在经戊二醛活化后的酶标板表面，并通过生物素-链霉亲和素放大系统进一步提高该检测方法的灵敏度。结果表明，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的灵敏度和最低检出限分别为12.9ng/ML和0.7ng/mL，CV%为1.8%~4.5%。新型氨基化小分子半抗原直接偶联ELISA具有灵敏度高，干扰少，检测步骤简便、操作安全，测定结果较准确可靠。

小分子半抗原；直接包被；ELISA

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种常见的广谱抗菌药，在高浓度时有很好的杀菌作用，在低浓度时能抑制多数细菌的生长，因此该抗生素在临床上广泛使用。对其敏感的细菌主要有克雷伯氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、产气杆菌、伤寒杆菌等。随着氯霉素应用的增加以及科学技术的发展，氯霉素已被证明对机体有非常大的毒副作用，如遗传毒性，骨髓造血机能抑制毒性，生殖毒性，神经毒性，灰婴综合症等。此外，长期微量摄入氯霉素不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生抗药性，而且还会导致机体正常菌落失调，使人们易患各种疾病。由此可见，氯霉素在动物性食品中的残留，通过水产品、肉制品、奶、蛋等作用于人类，使人们的健康在受到威胁。对此，联合国粮农组织、世界卫生组织和众多国家规定限制或禁止氯霉素用于食品动物[1-2]，中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除并列为禁药。而欧盟的进口食品卫生标准是：在进口动物产品中不得检出氯霉素，其“不得检出”的含义是氯霉素量在1μg/kg以下。2002年欧盟对我国出口到欧盟的动物源性产品实行禁运，就意味着我国将在欧盟市场丢掉13万吨的市场份额和造成6亿多美元的经济损失[3]。并且由于欧盟的禁令，美国和日本等国已高度关注我国出口水产品的质量。因此动物性食品中氯霉素的残留量分析，尤其是快速、准确、高灵敏度的检测方法，近年来得到国内外食品分析工作者的高度关注[4]。

目前氯霉素残留检测的方法主要有免疫学方法、色谱分析方法和微生物学方法。微生物法耗时长、重复性差、灵敏度低；色谱分析法需要昂贵的仪器，对检测技术人员要求高，样品前处理较为烦琐，成本较高，分析速度较慢，很难达到快速、简便和现场检测要求，更难以适应大量复杂样品的检测。而免疫分析方法，尤其是ELISA技术，一方面具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、分析容量大等优点，另一方面它对使用人员的技术要求不高也不需要贵重仪器设备[5-6]。

基于氨基化小分子半抗原与酶标板表面直接偶联技术以及生物素-链霉亲和素放大系统建立一种氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法，用于检测虾肉中的氯霉素残留量，并与传统ELISA法、高效液相色谱法（HPLC）进行比对，以验证该方法的准确性。

1 材料和方法

1.1 材料

氯霉素标准品、琥珀氯霉素、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二环乙基碳二亚胺（DCC）等购自美国Sigma-Aldrich公司。抗氯霉素抗体购自美国Abcam公司。MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 氯霉素-BSA偶联物、氨基化氯霉素和生物素化抗体的制备

称取18.4mg琥珀氯霉素、8.5mgDCC和4.8mgNHS溶解于2mLDMF中，缓慢振摇反应12 h，15 000 r/min离心8min后去除沉淀物。将上清液缓慢滴加到BSA（10mL，10mg/mL）溶液中，4℃反应过夜，然后将反应液置于PBS缓冲液（0.01mol/LPBS）中透析3 d，透析产物冷冻干燥后低温保存，即可获得氯霉素-BSA偶联物。

称取氯霉素67mg溶于700μL无水乙醇中，缓慢加入34mg锌粉，搅拌40min。反应结束后10 000 r/min离心8min除去沉淀物，进而获得氨基化氯霉素。

将BNHS溶解于DMF中配制成1mg/mL溶液，用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释至0.1mg/mL，将上述两种溶液按体积比为10∶1.5混合，室温下振荡反应4 h。反应结束后透析除去多余的生物素，即获得生物素化抗体。

1.2.2 氨基化小分子半抗原的直接包被ELISA

使用0.01mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液将6.5%戊二醛（GA），加入到中度吸附微孔板中，每孔200μL，37℃孵育1.5 h。洗涤液（PBST）洗涤5次。用PBS缓冲液将氨基化氯霉素稀释成适当浓度加入到微孔板中，37℃孵育1.5 h。PBST洗涤后，加0.15mol/L的氨基己酸溶液，37℃孵育1.5 h。洗涤后干燥保存。加入含有0.05%BSA的PBS（0.01 mol/L）溶液，每孔150μL，37℃反应1.5 h，倾去封闭液，拍干。加入适当浓度的生物素化抗体，100μL/孔，37℃孵育1.5 h。PBST洗涤四次后，每孔加入100μLHRP-标记亲和素，37℃孵育45min。PBST洗涤6次，每孔加100μL底物显色液，37℃孵育10min后每孔中加50μL 2mol/LH2SO4终止反应后，用酶标仪进行读数。传统ELISA步骤如Sai etal.[7]文章所示。

1.2.3 虾肉中氯霉素的提取和含量分析

氯霉素残留在水产品中广泛存在，本实验选用虾肉样品，分析样品中氯霉素残留状况。

1.2.3.1 免疫分析样品的前处理

准确称取4 g匀浆处理后的虾肉样品，加入10mL乙酸乙酯，震摇20min，6 000 r/min离心30min。取上清液用氮气吹干，加入2mL异辛烷/氯仿混合液（3∶2，v/v）以及2mLPBS（0.01mol/L，pH 7.4）溶解，混合液振荡2min，3 000 r/min离心10min，取上清液直接用于酶联免疫分析。

1.2.3.2 HPLC方法的样品前处理

准确称取4 g匀浆处理的虾肉，加入10mL乙酸乙酯室温下振荡20min，6 000 r/min离心10min，取上清液用氮气吹干，固体残渣使用4mL色谱纯甲醇溶解用于HPLC分析。

1.2.3.3 高效液相色谱分析条件

色谱柱：C18（250×4.6mm，5μm）；

进样体积：50μL；

流动相：甲醇-水（65∶35，V/V）；

流速：0.8mL/min；

检测波长：278 nm。

2 结果与分析

2.1 氯霉素-BSA偶联物的鉴定

通过紫外吸收图谱和质谱测定氯霉素、BSA和氯霉素-BSA偶联物。紫外吸收图谱中可知，氯霉素-BSA偶联物最大吸收峰位在278 nm处，与氯霉素最大吸收峰位基本相同，可初步判断氯霉素和BSA偶联成功。进一步质谱分析中可知，氯霉素-BSA偶联物分子量（76880）比BSA分子量（66997）有明显增大。由此可见，氯霉素-BSA偶联物制备成功。

2.2 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的检测灵敏度

表1分别表示了传统ELISA以及氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的检测灵敏度。

表1 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA和传统ELISA的检测灵敏度Tab le1 Sensitivitiesof BSAS-direct Hapten coated ELISA and conventionalELISA

从中可得出，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA和传统ELISA的灵敏度分别为12.9 ng/mL和70.6 ng/mL，最低检出限分别为0.7 ng/mL和6.3 ng/mL。由此可见，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的检测灵敏度显著高于传统ELISA。其原因可能有以下几点。首先，在传统ELISA中，氯霉素分子较小，与抗体反应的识别位点比较单一，与载体蛋白偶联过程中其特异性识别位点易被屏蔽，进而失去其结合的高亲和性。其次，在传统ELISA中，完全抗原是通过与聚苯乙烯表面的疏水作用力完成偶联，而此过程很可能引起载体蛋白空间结构发生变化，如疏水性基团大量暴露，导致小分子半抗原和抗体识别能力下降。而在氨基化小分子半抗原直接包被ELISA中，将氨基化小分子半抗原直接包被到微孔板表面的方式不但能够避免载体蛋白屏蔽作用，同时经戊二醛反应后的微孔表面形成网络结构起到连接臂作用，加大小分子半抗原与酶标板之间的空间距离，有利于小分子半抗原特异性识别位点暴露，有利于抗体和小分子半抗原的识别。此外，生物素-亲和素信号放大系统的使用，进一步提高检测灵敏度[7-8]。

2.3 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的检测特异性

表2为氯霉素抗体对四种结构类似物的交叉反应率，对其它几种结构类似物交叉反应率均小于1%。两种ELISA方法得到结果一致，表明该方法具有较高的特异性。

表2 氯霉素类似物的交叉反应率Tab le2 Cross-reactivitiesof the inhibition assayw ith selected coMpounds%

2.4 实际样品分析

为探讨氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法的适用性和有效性，我们将这种方法用于实际样品（虾肉）中氯霉素残留的检测，并与传统ELISA、HPLC等方法进行对比，结果见表3。

表3 虾肉中氯霉素残留的三种检测方法（n=3）Table3 Resu lts froManalysisofCAP in samp lesby BSAS-direct hapten coated ELISA，conventional ELISA and HPLC Method（n=3）

由表3可知，三种方法检测结果基本一致，同时氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的CV值在1.8%～4.5%之间，小于其它两种方法，呈现出更高的精确度和稳定性。由此可以表明这种新型ELISA模型可用于实际样品中兽药残留检测。

3 结论

通过戊二醛对聚苯乙烯微孔板进行处理，在微孔板表面产生带有醛基基团的网络结构，通过醛基与氨基化氯霉素的氨基反应，从而将氨基化小分子半抗原直接包被到微孔板表面。同时采用了生物素-链霉亲和素放大系统，可建立一种新型的氯霉素检测ELISA。该方法不仅避免小分子半抗原与大分子蛋白偶联的繁琐过程，而且其最低检出限（0.7 ng/mL）比传统ELISA最低检出限（6.3 ng/mL）提高了近9倍。将该新型的ELISA技术应用于实际样品中氯霉素残留检测，该方法具有较高的精确度和稳定性。由此可见，这种氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法在农药、兽药残留分析应用具有较大的潜力。

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AMination SmallMolecular Hapten Coup led Directly ELISA for the Detection of Chloramphenicol in Shrimp Samp les

SAINa1，WUYun-tang1，SUNZhong1，WU Lantuya2，HUANGGuo-wei1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，Schoolof Public Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China；2.Information Technology Engineering Department，XilingolVocationalCollege，Xilingol026000，InnerMongolia，China）

The novel ELISA was developed for monitoring chloramphenicol remains in food by the directly attaching smallmolecule haptenwith amino groups to themicrotiter plate surface.chloramphenicolwith aminogroupswasdirectly coated on thesurfaceofmicrotiterplatesby treatingwith glutaraldehydesolution，and biotinstreptavidin systeMwasemployed to improve thesensitivityofimmunoassay.Thesensitivityof thenew ELISAwas 12.9 ng/mL，CV%was1.8%-4.5%.The novelamination smallmolecule hapten coupled directly ELISA has manyadvantages，suchashigh sensitivity，lessinterference，simpleoperationand soon.

Smallmolecularhatpens；Directly coated format；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.017

2014-09-15

国家自然科学基金青年科学基金项目（81302430）；中国博士后科学基金面上资助项目（2014M560192）和天津市高等学校科技发展基金（20110143）

赛娜（1983—），女（蒙古），讲师，博士，研究方向：营养与食品卫生学。

*通信作者：黄国伟（1962—），男（汉），教授，博士，研究方向：营养与食品卫生学。