骨诱导天然煅烧骨无菌检查方法学验证

张成 康鹏 陈红娟

1 陕西省医疗器械检测中心 （西安 710075）

2 陕西瑞盛生物科技有限公司 （西安 710048）

骨诱导天然煅烧骨为源自牛骨的天然骨无机材料，按照严格的安全规范，经过多级净化工艺，从天然牛骨中提取出高纯度的骨无机材料，再复合经过多步骤纯化的牛骨胶原，其具有高度的骨引导结构及骨诱导活性。在临床上主要用于填充骨缺损和骨扩展，牙槽嵴的扩展、重建，填充拔牙窝，骨肿瘤引起的非承重部位骨缺损填充，种植牙手术，制备种植床，上颌窦提升术，牙周治疗，骨缺损的填充，引导组织再生术（GTR）等。按照医疗器械分类目录，该产品为三类植入式医疗器械，其医疗器械分类编码为6846，因此植入前须确保产品无菌。而该产品作为生物医用材料，国家目前未对其无菌方法学验证做出具体的检测要求，为了确保广大人民群众用械安全，我们对其无菌方法进行验证。

由于无菌检查时必须选择适宜的方法消除其对培养基干扰，才能保证检验结果的准确性和可靠性。为此我们按照《中国药典》2010 年版三部（附录ⅦA）无菌检查法项下直接接种法的要求对骨诱导天然煅烧骨进行了实验，对其无菌检查方法进行验证，现报道如下。

1.仪器与材料

1.1 LMQ.R-4060 压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械台式柜分厂）；GH-360ASB 型隔水式培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；JY-B210 型生化培养箱（上海虹浦仪器厂）。

1.2 骨诱导天然煅烧骨： 陕西瑞盛生物科技有限公司（规格：CBB-G1-C 批号：100901、100902、100903）。

1.3 菌株：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白 色 念 珠 菌 [CMCC(F)98001]、 黑 曲 霉[CMCC(F)98003]。以上菌株均由中国食品药品鉴定研究院提供。

1.4 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基 批号100322、改良马丁培养基 批号100202、营养肉汤培养基批号100309、营养琼脂培养基 批号100106、玫瑰红钠琼脂培养基 批号100312。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。

2.实验方法

2.1 菌液制备： 接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中；生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35˚C 培养24 小时；接种白色念珠菌至改良马丁液体培养基中，20～25˚C 培养48 小时；接种黑曲霉菌至改良马丁琼脂斜面，23～28˚C 培养7 天（用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，标准比浊管比浊）。以上培养物均用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液。

2.2 菌液计数：每种菌液接种2 个平皿，取其平均值。取金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液、枯草芽孢杆菌液各1ml，注入约15ml 营养琼脂平皿，30～35˚C 培养，白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入约15ml 玫瑰红钠琼脂培养基20～25˚C培养，计数。

2.3 方法验证试验

2.3.1 试验组：取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐培养基8 管，分别接种加入已制备好的金黄色葡萄球菌菌液、铜绿假单胞菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各1ml，取每管装量为9ml改良马丁培养基4 管接种分别加入已制备好的白色念珠菌菌液、黑曲霉菌菌液各1ml；其中1 管加供试品规定量（约0.5g），所有培养基管置规定的温度，培养3～5 天。如培养基各管24 小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。

2.3.2 供试品对照组：取供试品21 支，以无菌操作将该供试品分别加入硫乙醇酸盐流体培养基11 管，其中1 管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液50～100cfu/mL 做为阳性对照；另接种于改良马丁培养基10 管，轻轻振摇使供试品与培养基混合，按规定条件培养14 天,逐日观察。

2.3.3 阴性对照组：取硫乙醇盐培养基和改良马丁培养基，置规定条件培养14 天，逐日观察。

3.实验结果

3.1 菌液计数：结果见表1。

由表1 可知结果符合规定。

3.2 验证试验各组生长情况：结果见表2

由表2 可知各试验菌生长良好。

表1. 阳性对照菌计数结果

表2. 无菌检查方法验证试验结果

4.讨论

经过三次平行试验，与对照组比较，含供试品的各管中的试验菌均生长良好,并与各对照组中相应菌落生长情况相似，供试品对照组、阴性对照组和空白对照组均无菌落生长。由此说明，骨诱导天然煅烧骨在此检验条件下无抑菌作用，因此可按此检查法和检查条件进行骨诱导天然煅烧骨的无菌检查。另外，制备生孢梭菌菌混悬液时，动作要尽量轻，要将菌液加到氧化层下面，以免破坏氧化层环境；制备黑曲霉时，要关闭净化工作台风机，或者在生物安全柜中操作。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或灭活剂等方法来消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。

[1] 国家药典委员会 中华人民共和国药典 三部.北京;化学工业出版社,2010,附录ⅦA.