动员大鼠自体骨髓干细胞修复损伤心肌

王勃，佟文姝，李雯娜，郭潇繁

（中国医科大学附属第一医院1.心血管内科；2.心血管检查科，沈阳110001）

动员大鼠自体骨髓干细胞修复损伤心肌

王勃1，佟文姝2，李雯娜1，郭潇繁1

（中国医科大学附属第一医院1.心血管内科；2.心血管检查科，沈阳110001）

目的探讨应用rhG⁃CSF促进骨髓干细胞原位移植对损伤心肌的修复作用。方法采用异丙基肾上腺素腹腔注射建立大鼠急性心肌损伤模型；通过外源性细胞因子rhG⁃CSF动员骨髓干细胞增殖、释放、迁移归巢至损伤心肌局部；应用HE染色结合图像分析系统，对两组心肌进行对比性分析；应用八导记录仪检测心脏功能。结果原位移植组的心肌损伤面积小于对照组；原位移植组心脏收缩功能较对照组明显改善。结论腹腔注射异丙基肾上腺素可复制急性心肌损伤模型；应用骨髓干细胞动员剂rhG⁃CSF，可促进坏死心肌修复，提高心脏收缩功能。

骨髓干细胞；急性心肌损伤；rhG⁃CSF

人类的心脏虽然不是一终末分化器官，但是成体心脏干细胞的数量极少［1］，另外目前的药物和介入治疗虽然能有效地干预急性心肌损伤（acute myo⁃cardial injury，AMI）的发生和预后，但这些都不足以代偿损伤的心肌，最终由纤维母细胞增生形成纤维瘢痕替代原心肌组织，导致心脏收缩功能减低。近年来自体细胞移植为心脏疾病的治疗展示了一幅美好的前景，研究表明：再生能力较强的骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSC）具有向其他组织横向分化的能力，这对于缺乏干细胞的心脏组织再生非常重要。粒细胞集落刺激因子（granulocyte col⁃ony stimulating factor，G⁃CSF）是一种糖蛋白，由单核细胞和巨噬细胞产生，可作用于BMS，促进其增值、分化［2～4］。本项研究中，我们启用外源性细胞因子，观察自体BMSC通过增殖、释放、迁移、归巢、转分化，对损伤坏死心脏的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器：日本日立7150型全自动生化分析仪、自动石蜡切片机（RM2155 Model，Germany）、光学显微镜（BX60 Model，OLYMPUS，Japan）、图像采集系统（BX41 Model，OLYMPUS，Japan）、显微图像分析处理系统（MetaMorph/DP10/BX51 VS.VIC/JP Model，OLYMPUS，Japan）、八导生理记录仪（RM⁃6000 Model，NIHON KOHDEN）。

1.1.2 实验药品与试剂：异丙基肾上腺素注射液（上海禾丰制药厂生产）、rhG⁃CSF（长春金磊赛强生物制药有限公司提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：领取Wistar大鼠60只，雌、雄各半，体质量（255±44.68）g。随机分为原位移植组（si⁃tu transplantation group，STG）30只，对照组30只。

1.2.2 rhG⁃CSF干预：STG：rhG⁃CSF 50 μg/（kg·d）、皮下注射8 d。对照组：等量生理盐水皮下注射8 d。

1.2.3 建立大鼠急性心肌损伤模型：参照文献［5，6］，STG、对照组分别于rhG⁃CSF、生理盐水干预第5天，以异丙基肾上腺素（10 mg/kg）腹腔注射。

1.2.4 检测血清心肌酶学：于造模前、后48 h，穿刺尾静脉，留取外周血，并于全自动生化分析仪检测血清肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase，CPK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

1.2.5 制备大鼠心肌损伤标本：于造模后48 h、1周，STG、对照组随机各取2～3只大鼠处死、前胸剃毛、无菌消毒后取出心脏，于生理盐水中冲洗，沿心脏长轴将其切为2部分。10%甲醛溶液中固定48 h，取出后依次放入浓度为60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水⁃二甲苯透明40 min、58～60℃石蜡中浸蜡90 min制备蜡块、切片、展片、烤片。行苏木素-伊红（HE）组织化学染色，光学显微镜下观察。

1.2.6 计算心肌损伤、坏死面积：将石蜡块以每隔100 μm间距切取5 μm厚，每块石蜡块取4片，行HE染色后通过显微图像分析系统计算每张切片中心肌损伤、坏死区占整个心室肌总面积的百分比。

1.2.7 检测各项心脏功能指标：调整八导生理记录仪各项参数。将造模后4周大鼠以苯巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔内注射麻醉。固定四肢、剃毛、头颈部消毒、依次切开皮肤及皮下组织，游离颈动脉，下方备用2根缝合线，近头端扎紧，近心端待用，动脉夹阻断血流，剪开动脉周长的1/3，插入充满肝素的导管，待用线固定，连接多导仪换能器，拧开动脉夹。示波仪显示动脉波形曲线，走纸记录，将导管继续送入左心室。示波仪显示左心室压力曲线，走纸记录。处死大鼠后留取心脏，标本制备过程同前。

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件行数据处理。

2 结果

2.1 心肌酶学变化

心脏坏死标志物——心肌酶学变化两组比较，差异有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 比较两组造模前、后心肌酶学变化Tab.1 Changes of myocardial enzyme between two groups before and after modeling

表1 比较两组造模前、后心肌酶学变化Tab.1 Changes of myocardial enzyme between two groups before and after modeling

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2.2 形态学变化

显微镜下观察：两组于造模后48 h均可见：乳头肌、心尖部、内膜中层心肌纤维呈现网格状改变，其内分布大量核大深染、胞质少的炎性细胞，为心肌坏死灶（图1～3）。造模后1周：可见STG网格状面积缩小，其内可见限局性单个核细胞聚集灶，较前比较胞质增多、胞核小、深染、似分化的心肌细胞。而对照组仍见散在的索条状、网格状坏死灶，浸润的炎性细胞明显减少（图4）。

2.3 两组心肌损伤面积的比较

应用显微图像分析处理系统计算每张切片中损伤坏死心肌占心室肌总面积的百分比，采用SPSS统计学软件分别比较造模后48 h、1周、4周的组间差异，见表2。

2.4 STG、对照组间心功能参数的比较

图1 正常心肌组织HE染色×400Fig.1 Normal myocardial tissue in rat HE staining，×400

两组于造模后4周采用八导生理记录仪记录颈动脉内、左心室压力曲线，进而推算出各心功能参数，见表3。

图2 STG AMI后48 h HE染色Fig.2 48 hours after AMI in STG HE staining

图3 对照组AMI后48 h HE染色Fig.3 48 hours after AMI in control HE staining

图4 AMI后1周HE染色Fig.4 1 week after AMI HE staining

表2 STG与对照组间心肌损伤面积的比较Tab.2 Comparison of myocardial necrosis area between STG and control group

3 讨论

依据干细胞分化潜能可分为：全能干细胞、多潜能干细胞、成体干细胞。因其具有自我复制、可无限扩增及定向诱导分化等特点，近来已成为基础及临床研究热点。Doetachman等［7］于1985年首次报道了小鼠胚胎干细胞向内脏卵黄囊、血岛及心肌细胞定向分化的现象，以后又陆续从猪、兔、及人类等胚胎干细胞分化出心肌细胞，为以后非心脏干细胞向心肌移植奠定了理论基础。

成体干细胞为所在组织器官的前体细胞，具有转分化或横向分化的特点，即某种前体细胞经损伤微环境的作用、细胞因子的诱导横向分化为另外一种细胞，如骨髓干细胞、表皮干细胞、骨骼肌成肌细胞等，这对于缺乏干细胞的成体心脏组织损伤坏死后的再生具有积极的治疗意义。其中原始的BMSC可在体内、外长期生长，可横向分化成血管内皮细胞、心肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、成纤维细胞等。利用BMSC这种可塑性来修复损伤坏死的心脏组织，在很多动物实验、临床试验中得到了进一步证实［8，9］。其机制可能为：（1）BMSC在心脏损伤坏死微环境作用下横向分化成心肌细胞和（或）心肌样细胞，并与宿主心肌细胞形成电-机械偶联，进而改善心脏功能；（2）BMSC分泌细胞因子，改善损伤坏死微环境，促进心脏修复。

表3 两组间各指标均值比较Tab.3 Comparison of mean level between two groups

正常生理状态下，外周血中造血祖细胞仅占单个核细胞的0.01%～0.1%，约为骨髓的1%～10%。如正常稳定状态下CD34+细胞占外周血有核细胞总数的0.06%，经过G⁃CSF动员后CD34+细胞可占外周血有核细胞总数的0.75%［10］。据此，当心肌出现急性缺血性损伤坏死时，可通过外源细胞因子—rhG⁃CSF的干预，促进其修复。

本实验正是基于上述理论及研究背景，建立Wistar大鼠AMI模型，采用外源性细胞因子动员自体BMSC，通过形态学观察、心脏收缩功能检测发现：于造模后48 h，两组心室肌内均可见网格状灶性坏死，其内分布核大深染，胞质少的椭圆形、圆形小细胞浸润，可能为归巢的BMSC。造模后1周的STG可见浸润的圆形小细胞的胞质增多、胞核变小，其排列与周围的心肌细胞具有一定的同向性，似转分化的心室肌细胞，对照组未见此改变。另外分别于造模后第1周、第4周进行两组间心肌损伤坏死面积的比较发现：STG心肌损伤坏死面积小于对照组（P＜0.05）。综上分析可能为动员的BMSC归巢至心室损伤坏死区，在局部损伤微环境及细胞因子作用下向心脏组织分化、减轻了纤维母细胞的纤维化。另外，已有研究表明BMSC还可促进血管新生［11］，改善局部供血，从而改善心功能及预后，这与本研究在造模后4周进行的左心导管检测结果相一致：STG的颈动脉内血压、左室内压峰值、左室内压最大变化速率均显著优于对照组（P＜0.01），左室舒张末压明显低于对照组（P＜0.01）。

以往大多数动物、临床研究多采用先体外培养扩增BMSC，再经冠脉内、心内膜注入心肌。研究表明：干细胞经体外培养扩增后，其生物学特性会发生很大变化，如细胞体积扩大、体内外环境不同易至细胞分化、归巢能力降低等，这些都将影响细胞移植的效果。而通过细胞因子启动自体BMSC进行原位移植，不改变BMSC生存内环境、过程简单、无创伤性，有待进一步研究与推广。

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（编辑 裘孝琦）

Mobilization of Autologous Bone Marrow Stem Cells to Repair Myocardial Injury in Rat

WANG Bo1，TONG Wen⁃shu2，LI Wen⁃na1，GUO Xiao⁃fan1
（1.Department of Cardiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Cardiovascular Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the repair effect for in⁃situ transplantation of bone marrow stem cells for acute myocardial injury in rats.Meth⁃odsAcute myocardial injury model was established by intraperitoneal injection of isoproterenol 10 mg/kg in rat.Autologous bone marrow stem cells were mobilized by cytokine，released and homed to local injured myocardium.A comparative analysis on pathological section between two groups was performed by HE staining and image analysis system.Heart functions were determined by eight lead physiological polygraph system.ResultsThe myocardial necrosis area in in⁃situ transplantation group was less than that of the control group.The cardiac systolic function was significantly im⁃proved in in⁃situ transplantation group compared to the control group.ConclusionAcute myocardial injury model could be established by isoprena⁃line administration.Myocardial necrosis were repaired and cardiac systolic function was improved by using cytokines.

bone marrow stem cells；acute myocardial injury；rhG⁃CSF

R541

A

0258-4646（2014）07-0621-04

辽宁省教育厅高校科研计划（L2010656）

王勃（1969-），女，主治医师，博士.

2014-05-13

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