高锌抑制鼠前列腺癌细胞RM⁃1侵袭与诱导凋亡的实验研究

王波，汲坤，张丽艳，尚德志，李璞宸，刘璐璐

（1.内蒙古民族大学第二临床医学院病理科，内蒙古民族大学分子病理学研究所，内蒙古林业总医院病理科，内蒙古牙克石022150；2.沈阳医学院病理生理学教研室，沈阳110034；3.沈阳医学院颌面外科，沈阳110034；4.沈阳医学院2011级医学影像学，沈阳110034）

高锌抑制鼠前列腺癌细胞RM⁃1侵袭与诱导凋亡的实验研究

王波1，汲坤2，张丽艳2，尚德志3，李璞宸4，刘璐璐4

（1.内蒙古民族大学第二临床医学院病理科，内蒙古民族大学分子病理学研究所，内蒙古林业总医院病理科，内蒙古牙克石022150；2.沈阳医学院病理生理学教研室，沈阳110034；3.沈阳医学院颌面外科，沈阳110034；4.沈阳医学院2011级医学影像学，沈阳110034）

目的探讨锌对鼠前列腺癌细胞RM⁃1侵袭能力和凋亡的影响。方法将RM⁃1细胞培养于含Zn2+的培养基中，Zn2+终浓度分别为0 μmol/L（control）、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，继续培养24 h，MTT检测锌对RM⁃1细胞增殖的影响；RT⁃PCR检测肿瘤侵袭和凋亡相关基因mmp⁃2、mmp⁃9、bax和bcl⁃2mRNA表达。结果MTT检测结果显示，与对照组比较，不同浓度锌对RM⁃1细胞增殖抑制率明显增加（P＜0.05）；与100 μmol/L组、200 μmol/L组比较，250 μmol/L组、300 μmol/L组细胞增殖抑制率明显增加（P＜0.01）。RT⁃PCR结果显示，与对照组比较，250 μmol/L、300 μmol/L组mmp⁃2和mmp⁃9mRNA及bcl⁃2mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）；baxmRNA表达水平明显升高（P＜0.01）。结论高锌可以降低RM⁃1细胞的增殖和侵袭能力，诱导RM⁃1细胞的凋亡。

锌；前列腺癌；基质金属蛋白酶；凋亡

前列腺癌（prostate carcinoma，PCa）是男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势［1］。正常人前列腺组织中锌的含量远较其他组织高，前列腺癌组织中锌的浓度明显低于正常前列腺组织和前列腺增生组织［2］。在前列腺癌筛查中，锌可作为辅助诊断的指标之一［3］。目前锌在前列腺癌发生发展中的作用越来越受到关注，但具体的作用机制还不明确。本研究应用锌作用于鼠前列腺癌RM⁃1细胞株，观察其对肿瘤细胞的增殖和侵袭能力以及凋亡的影响，为深入研究锌在前列腺癌及前列腺癌发病相关基因中的作用机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠前列腺癌细胞株RM⁃1购自上海细胞所。IMDM培养基和胰蛋白酶购自Hyclone公司，胎牛血清和Trizol购自Invitrogen公司，MTT和DMSO购自Sigma公司，M⁃MuLV和dNTP购自Promega公司。TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，ZnSO4·7H2O为国产AR级，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：小鼠前列腺癌细胞株RM⁃1培养于含10%胎牛血清的IMDM培养液中，置于5%的CO2、37℃恒温孵箱中培养。待细胞生长达到80%融合时，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，传代，更换新鲜的含10%胎牛血清的IMDM培养基，传代比率为1∶2或1∶3。

1.2.2 MTT比色法检测细胞活力：取对数生长期的RM⁃1细胞，以每孔4×104细胞接种于96孔板中，每孔体积200 μL，放入培养箱中孵育24 h后，每组加入含不同浓度Zn2+培养液200 μL。每组6复孔，锌的终浓度分别为0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，培养20 h后每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μL，于培养箱中继续培养4 h，出现蓝色结晶后弃孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，用酶标仪检测波长570 nm时各孔的吸光度值，每组6孔数据取平均值，按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率（%）=实验组光密度值/对照组光密度值×100%

1.2.3 RT⁃PCR检测RM⁃1细胞中mmp⁃2、mmp⁃9、bax和bcl⁃2mRNA的表达：取对数生长期的RM⁃1细胞，Zn2+分为0 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L 3组，于作用24 h后收集细胞。加入Trizol抽提总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，分别用mmp⁃2、mmp⁃9、bax、bcl⁃2及GAPDH的引物进行PCR扩增，取PCR产物进行电泳，采用天能凝胶成像系统拍照并分析条带灰度，实验重复3次。引物序列如表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of primers for PCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度锌对RM⁃1细胞增殖活力的影响

MTT结果显示：与对照组比较，100 μmol/L Zn2+作用后RM⁃1细胞增殖抑制率增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L作用后RM⁃1细胞增殖抑制率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与100 μmol/L、200 μmol/L Zn2+组比较，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM⁃1细胞增殖抑制率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 MTT法检测不同剂量锌对RM⁃1细胞增殖的影响（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM⁃1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

表2 MTT法检测不同剂量锌对RM⁃1细胞增殖的影响（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM⁃1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs control group.3）P＜0.01 vs 100 μmol/L and 200 μmol/L Zn2+group.

?

2.2 锌作用后RM⁃1细胞中肿瘤侵袭相关基因mmp⁃2和mmp⁃9mRNA表达的变化

与对照组比较，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM⁃1细胞中mmp⁃2和mmp⁃9mRNA的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图1和表3。

图1 锌作用后RM⁃1细胞中mmp⁃2和mmp⁃9mRNA的表达Fig.1 The expression of mmp⁃2 and mmp⁃9 mRNA in RM⁃1 cells after zinc treatment

2.3 锌作用后RM⁃1细胞中肿瘤凋亡相关基因Bax和Bcl⁃2mRNA的表达的变化

表3 各组RM⁃1细胞中mmp⁃2和mmp⁃9mRNA的表达水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp⁃2 and mmp⁃9 mRNA in RM⁃1 cells of different groups（n=3

表3 各组RM⁃1细胞中mmp⁃2和mmp⁃9mRNA的表达水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp⁃2 and mmp⁃9 mRNA in RM⁃1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group.

与对照组比较，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM⁃1细胞中BaxmRNA表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与对照组比较，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM⁃1细胞中Bcl⁃2mRNA表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图2和表4。

图2 锌作用后RM⁃1细胞中Bax和Bcl⁃2mRNA的表达水平Fig.2 The expression of Bax and Bcl⁃2mRNA in RM⁃1 cells after zinc treatment

表4 各组RM⁃1细胞中Bax和Bcl⁃2mRNA的表达水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl⁃2 mRNA in RM⁃1 cells of different groups（n=3

表4 各组RM⁃1细胞中Bax和Bcl⁃2mRNA的表达水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl⁃2 mRNA in RM⁃1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group

3 讨论

在美国前列腺癌占男性恶性肿瘤的首位，死亡率居第二位［4］。在中国近年来也呈逐年上升趋势，上海市市区前列腺癌发病率1989年至2009年20年间前列腺癌发病率增长10余倍；北京市前列腺癌发病率由2001年的5.53/10万上升至2010年的16.62/ 10万；吉林大学前列腺疾病防治中心进行的长春50岁以上男性前列腺癌集团筛查也证实前列腺癌发病率的上升趋势［5］。

锌是人体必需的微量元素，参与人体内多种酶的构成，在核酸代谢、细胞复制、免疫活性、组织修复和生长方面起重要作用。流行病学调查显示，前列腺癌与组织内低锌含量密切相关［6，7］，前列腺组织低锌含量与PSA生化复发密切相关［8］。在前列腺癌诊断后，经过中位周期6.4年的观察，高锌饮食摄入可以降低前列腺癌特异死亡率，但是与锌有关的前列腺癌生存期延长的机制不明［9］。另有研究发现血清锌含量在前列腺癌治疗前后明显不同。

侵袭与转移是前列腺癌患者的致死原因之一，肿瘤细胞的侵袭和转移潜能与其产生MMPs的能力密切相关。MMPs特别是mmp⁃2和mmp9的表达升高与前列腺癌远处转移和淋巴结侵袭密切相关。在前列腺癌动物模型中应用MMPs合成抑制剂，可以减少肿瘤的生长和延长动物的生存时间［10］。另有研究表明锌可以诱导肿瘤细胞的坏死和凋亡［11］。

本实验应用MTT检测锌作用后前列腺癌细胞的增殖活性结果表明锌明显抑制了前列腺癌细胞的增殖活性。RT⁃PCR结果显示，锌明显抑制了肿瘤侵袭相关基因mmp⁃2和mmp⁃9mRNA的表达；锌增强了凋亡相关基因Bax的表达，抑制了Bcl⁃2的表达。上述结果表明锌可以抑制前列腺癌的增殖和侵袭以及诱导前列腺癌细胞的凋亡。因此只有理解锌抗肿瘤的基础机制后，才能正确和有效的将其运用到肿瘤的治疗中。我们将在后期研究中进一步明确锌在前列腺癌发生发展中的作用机制，为最终通过锌制剂的干预来预防早期前列腺癌的发生、发展以及减少手术后的前列腺癌患者复发提供实验依据。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

［2］Tsuchiya N，Ohyama C，Habuchi T.Tumor markers in prostate can⁃cer⁃clinical significance and future prospect of prostate specific anti⁃gen（PSA）［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2005，32（2）：275-280.

［3］李晓萌，李江，张灵，等.血清锌在前列腺癌筛查中的意义［J］.中国实验诊断学，2006，10（2）：132-135.

［4］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the im⁃pact of eliminating socioeconomic and racial disparities on prema⁃ture cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

［5］张灵，计国义，李晓萌，等.前列腺癌集团检诊对临床前列腺癌诊断的影响［J］.中华泌尿外科杂志，2004，25（2）：103-105.

［6］汲坤，张灵，邵月婷，等.前列腺癌患者血清中铜、锌与铜/锌比值的变化及意义［J］.中国男科学杂志，2007，21（5）：9-14.

［7］Franklin RB，Feng P，Milon B，et al.hZIP1 zinc uptake transporter down regulation and zinc depletion in prostate cancer［J］.Mol Can⁃cer，2005，4：32.

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（编辑 裘孝琦）

Zinc Inhibits Invasion and Induces Apoptosis of RM⁃1 Cells in vitro

WANG Bo1，JI Kun2，ZHANG Li⁃yan2，Shang De⁃zhi3，LI Pu⁃chen4，LIU Lu⁃lu4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities；Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities；Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 medicalimaging，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo investigate the effects of zinc on the invasion and apoptosis of RM⁃1 cells.MethodsThe RM⁃1 cells were exposed to differentconcentration ofzinc for24 h.MTT was used to detectthe proliferation rate ofRM⁃1cells.RT⁃PCRwas used to detectthe mRNA expression of invasion and apoptosis⁃related genes includingmmp⁃2，mmp⁃9，baxandbcl⁃2.ResultsCompared with control group，the proliferation rates of RM⁃1 cells in different concentration of zinc groups were lower（P＜0.05）.Compared with 100 μmol/L and 200 μmol/L groups，the proliferation rates of RM⁃1 cells in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups were significantly inhibited（P＜0.01）.Compared with control group，the expression ofmmp⁃2，mmp⁃9andbcl⁃2mRNAs were decreased and the expression ofbaxmRNA was significantly increased in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups（P＜0.01）.ConclusionZinc can inhibit proliferation and invasion，and induce apoptosis of RM⁃1 cells.

zinc；prostate cancer；matrix metalloproteinase；apoptosis

R73

A

0258-4646（2014）07-0589-03

国家自然科学基金（81260310）；辽宁省博士科研启动基金（20111126）；沈阳医学院科技发展基金（20113069）

王波（1976-），男，副主任医师，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-05-22

网络出版时间：