两种植物水浸提液对水华微囊藻的化感作用

王 捷，王志强，冯 佳，谢树莲

(山西大学生命科学学院，山西太原 030006)

近年来一些池塘、湖泊及海洋富营养化问题越来越严重，进而引起浮游藻类过量繁殖形成水华，其中以蓝藻水华尤为常见［1-4］。因此，有效控制浮游藻类大量繁殖，防止水华发生极为重要。有学者报道水生植物可作为净化污染水体，吸附重金属和防治富营养化的有效手段［5-7］。水生植物分泌的化感物质抑藻由于具有高效、快速、生态安全性好等特点，也被认为是一种颇有前景的控藻方式［8，9］。

化感作用指一种植物与其他植物或微生物之间的化学相互作用，在自然界中非常普遍。在水生生态系统中利用植物化感作用控制藻类繁殖的研究也易受到关注。门玉洁等［10，11］研究了芦苇(phragmites australis)化感组分对斜生栅藻(scenedesmus obliquus)、羊角月牙藻(selenastrum capricornutum)和莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)生长特性的影响。还有研究表明芦苇化感物质对铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)和蛋白核小球藻chlorella pyrenoidosa)细胞膜的选择透性有影响，而对普通小球藻(C. vulagaris)的细胞膜选择透性则没有显著影响［12-14］。

水华微囊藻(microcystis flosaquae)是一种常见的水华藻类，适应性强、爆发率高，可产生微囊藻毒素，威胁其他水生生物生态功能的正常发挥，甚至影响人类健康［1］。本研究以水华微囊藻为研究对象，比较了北方地区两种常见的水生植物水浸提液对叶绿素α 和超氧化物歧化酶(SOD)的影响，以期为水华防控研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物水浸提液制备

两种水生植物——香蒲(typha orientalis)和穗状狐尾藻(myriophyllum spicatum)，均采自山西太原市。将采集的植物体用自来水反复清洗干净后，再用蒸馏水冲洗;剪碎置于80 ℃烘箱中干燥48 h;粉碎研磨过200 目筛，得到粉末;向1 L 锥形瓶中加入60 g 粉末和300 mL MA 培养液，置于恒温(25 ℃)震荡器中提取48 h;减压抽滤，经0.45 μm 滤膜过滤除去颗粒性杂质及细菌以消除其他微生物的影响，所得滤液即为植物水浸提液。

1.1.2 水华微囊藻及培养

水华微囊藻分离自江苏无锡太湖，在无菌条件下转接至MA 培养液中，于人工气候箱(SPX-250BG，上海博讯)中培养1 周，至对数生长期时进一步扩大培养。培养温度为(25 ± 0. 5)℃、光暗比为12 h∶12 h、光照度为3 000 lx，静置培养，每天定时摇动2 次。

1.2 试验方法

1.2.1 化感作用试验

向250 mL 锥形瓶中加入150 mL MA 培养液，高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下分别接入10 mL 生长状况一致的水华微囊藻;培养至对数期(15 ～20 d)后分别加入0、5、10、20、30 和40 mL 植物水浸提液;依次加入灭菌MA 营养液，使培养液总体积为200 mL。植物水浸提液试验组浓度梯度为0(对照组)、5、10、20、30 和40 g/L，每组设3 个重复。人工气候箱培养温度为(25 ±0.5)℃、光强3 000 lx、光暗比为12 h∶12 h，静置培养，每天定时摇动2 次，并随机调换三角瓶位置，隔24 h 取样进行指标测定［15］。

1.2.2 叶绿素α 含量测定

取一定量的藻液用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城)抽滤，抽干后将藻及滤膜一起放入具塞离心管中;加入体积分数为95%的乙醇溶液至10 mL，振荡提取叶绿素，放置于暗处过夜;在4 500 r/min 转速下离心15 min，取上清液，用紫外分光光度计(SP-752，上海光谱)测定叶绿素α 吸光值。

1.2.3 SOD 活力测定

取一定量藻液于4 500 r/min 下离心15 min;弃上清液，加入1 mL pH 为7.2 的0.05 mmol/L 磷酸缓冲液;用吸管转移至离心管中进行破碎，条件为工作1 s、间隙2 s，功率400 W，破碎30 次;破碎(Scientz-ⅡD，宁波新芝)后用冷冻离心机(HC-2518R，安徽中科中佳)在1 200 r/min 下离心15 min;于4 ℃下保存上清液，次日测其SOD 活力。SOD 活力的测定按照南京建成生物工程公司试剂盒说明进行，单位为U/mgprot，所用仪器为紫外分光光度计(SP-752，上海光谱)。

2 结果与分析

2.1 对水华微囊藻叶绿素α 含量的影响

经测定和计算可得，对照组和香蒲各处理组的叶绿素α 的初始值为(0. 685 ±0. 132)mg/L。由图1a 可知对照组和不同浓度香蒲处理组的叶绿素α 含量总体呈上升趋势，但随着处理时间的延长，处理组叶绿素α 含量的增长率有所下降，高浓度处理组(40 g/L)下降也不明显，说明香蒲水浸提液对水华微囊藻的叶绿素α 虽有一定的破坏但作用不强。

经测定和计算可得，对照组和穗状狐尾藻各处理组的叶绿素α 的初始值为(1. 328 ±0.015)mg/L。由图1b 可知与对照组相比，穗状狐尾藻较低浓度处理组(5、10 和20 g/L)叶绿素α含量没有太大变化，而较高浓度处理组(30 和40 g/L)叶绿素α 含量则明显下降，说明较高浓度的穗状狐尾藻水浸提液对水华微囊藻的叶绿素α 产生了破坏作用。

叶绿素α 在光合作用中承担着吸收和转化光能的作用，其含量常与藻细胞的生长状态和光合作用密切相关［16-18］。当藻体受到环境胁迫时，反映其生长状态和光合作用的叶绿素α 含量就会发生变化。由试验结果可知，在一定程度上两种植物水浸提液对水华微囊藻叶绿素α 含量存在着低浓度促进和高浓度抑制的作用。研究表明大多数植物化感物质会对光系统Ⅱ产生影响，低浓度的化感物质可能有利于藻类叶绿素生化合成进而促进光合作用和藻类生长，而高浓度化感物质通过破坏藻类的叶绿素，减少其同化产物从而抑制藻类生长［19，20］。有报道凤眼莲(eichhornia crassipes)根系附着的藻细胞中叶绿素α 的含量明显下降，而其降解产物脱镁叶绿素α 酸酯的含量升高［21］，这表明化感物质可能促进了叶绿素α 的降解。从试验结果看，两种植物水浸提液对水华微囊藻叶绿素α 的破坏程度有差异，香蒲的作用不及穗状狐尾藻，这也提示我们在实际应用中可有所选择。

2.2 对水华微囊藻SOD 活性的影响

经测定和计算可得，对照组和香蒲各处理组的初始SOD 为(18.183 ±0.122)U/mgprot。由图2a可知与对照组相比，香蒲各浓度处理组SOD 活性都有升高的趋势，到第4 d 时，SOD 活性又回落。说明香蒲水浸提液对水华微囊藻起到了一定的胁迫作用，使其产生应激反应，SOD 活性随之升高，以保护藻细胞。

图1 不同浓度香蒲和穗状狐尾藻水浸提液对水华微囊藻叶绿素α 含量的影响Fig.1 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on Chlorophyll α Content of Microcystis Flosaquae

经测定和计算可得，对照组和穗状狐尾藻各处理组的SOD 初始值为(0. 331 ±0. 020)U/mgprot。由图2b 可知与对照组相比，穗状狐尾藻各浓度处理组SOD 活性也都出现升高的趋势，不同浓度处理组SOD 活性都有上升趋势，且具有剂量效应，浓度越高SOD 活性升高的趋势越大，至第8 d 时，SOD 活性才开始下降，但均低于对照水平。说明穗状狐尾藻水浸提液对水华微囊藻起到了胁迫作用，而且其作用强于香蒲水浸提液。

SOD 能及时清除细胞在受胁迫过程中产生的过量超氧阴离子(O2-)，抑制膜脂的过氧化反应，使机体免受活性氧的损害，是机体内重要的保护酶。藻细胞在受到环境胁迫时，其细胞活性氧的产量会增加，抗氧化体系不及时清除这些活性氧，就会导致植物细胞内发生过氧化反应，尤其是脂质过氧化反应，破坏细胞内膜系统，导致细胞死亡。本试验结果表明将植物水浸提液加入藻液时，处理组SOD 活性上升，表明细胞内氧自由基浓度上升，为了清除这些过量的氧自由基，SOD 活性也随之上升，当清除完过多的超氧阴离子后，其活性也随之下降。然而当细胞内氧自由基浓度超过一定范围后，机体自身的抗氧化体系不能完成清除，则机体功能不能恢复，从而抑制了藻细胞生长繁殖［22］。

图2 不同浓度香蒲和穗状狐尾藻水浸提液对水华微囊藻SOD 活性的影响Fig.2 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on SOD Activity of Microcystis Flosaquae

3 结论

(1)香蒲和穗状狐尾藻水浸提液低浓度处理(5、10 和20 g/L)对水华微囊藻的叶绿素α 影响不明显或略有促进作用，高浓度处理(30 和40 g/L)则有明显的抑制作用。

(2)香蒲和穗状狐尾藻水浸提液处理对水华微囊藻的SOD 活性有明显影响，且存在剂量效应，浓度越高影响越大。

(3)从本试验对叶绿素α 和SOD 活性的研究结果可知穗状狐尾藻水浸提液对水华微囊藻的化感抑制作用要强于香蒲。

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