国产六种小型蝰科毒蛇蛇毒免疫原性比较

张艳霞，刘 虞，蔡梦思，单琳琳，高建芳

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

蛇毒是多种酶类和非酶类蛋白的混合物，包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、L 氨基酸氧化酶、磷脂酶A2、去整合素和半胱氨酸富集蛋白等，有助于毒蛇捕杀和辅助消化猎物［1］.毒蛇咬伤会导致患者呼吸衰竭、组织坏死、肾衰竭和凝血系统障碍等多种临床症状，是危害人类健康的世界性问题和重要急症之一.统计显示，全世界每年约有180万人被毒蛇咬伤，其中约9.4万人死亡.亚洲地区毒蛇资源丰富，蛇伤危害尤为严重，每年约有120万人中毒，导致约5.8万人死亡［2］，大部分致伤事件是由眼镜蛇科和蝰科毒蛇造成的［3］.在中国，毒蛇致伤事件主要集中于长江以南省份，其中蝰科毒蛇咬伤率高达65.7%［4］.据物种名录记载，中国24种蝰科毒蛇，隶属于8个属.蝰科毒蛇分泌的毒液主要含血循毒，对血液循环系统的破坏严重，患者中毒后以出血和组织坏死为主要特征［5］.由于蛇毒在体内扩散较快，因而抢救越及时越好.临床上，抗蛇毒血清能及时、有效地中和蛇毒，被世界公认为是治疗毒蛇咬伤的最佳药品［6］.

蛇毒是蛇类适应进化的产物，使毒蛇的捕食方式从单纯的机械手段向化学手段转变［7］.蛇毒组成与功能的差异备受毒理学家和爬行动物学家的关注，迄今为止已在种上和种下水平的研究中取得了大量的进展［8-9］.蛇毒种下水平的差异受季节、地理分布、年龄和性别等多种因素的影响，种上水平的差异主要受分类地位差异的影响.一般而言，蛇毒组成的差异常表现为同类毒素家族表达水平的不同，或者有限种毒素的有无［10］.近年来，蛋白质组学技术已成为蛇毒差异研究的主流手段，对种间、亚种间蛇毒组成差异的解析也更加透彻.Calvete等采用RP-HPLC、SDS-PAGE、ESI-MS和MALDI-TOF-MS技术分析了毒伊蛇（Toxicocalamuslongissimus）和青环海蛇（Hy drophiscyanocinctus）的蛇毒蛋白组构成，发现两种蛇毒主要由Ⅰ型磷脂酶A2和三指毒素构成；但两种组分的丰度存在明显的种间差异，二者在毒伊蛇中分别占6.5%和92%，在青环海蛇中分别占19%和81%；此外，毒伊蛇毒中含1.4%的PIII-金属蛋白酶，青环海蛇毒则不含此组分［11］.Castro等利用相同的蛋白组分析方法结合生理生化活性检测研究了墨西哥响尾蛇（Crotalussimus）3个亚种蛇毒组成和活性的差异，发现其中具有神经毒性的crotoxin毒素在不同亚种蛇毒中的含量存在显著差异：Crotalussimussimus最高达14.3%，Crotalussimustzabcan次之，而Crotalus simuscalminatus几乎不含这一成分；活性分析进一步证实，组分的差异与C.s.simus具有较高的致死率、肌肉毒性和促凝剂活性相吻合［12］.

研究蛇毒不同水平的差异有助于了解蛇毒的进化适应意义，对于蛇伤治疗时抗蛇毒血清的选择以及抗血清制备策略的完善更具有重要的指导意义.目前，中国正式上市销售的仅有抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清可用于治疗蝰科毒蛇所致蛇伤［13］.对于物种资源保有量较高的蝰科物种，其蛇毒与这两种抗蛇毒血清的临床前评估工作已有报道.早在1981年，蒋克贤等人就用免疫扩散与交叉中和反应研究了浙江蝮蛇毒抗血清对不同地理来源的蝮蛇毒和蝮亚科其它蛇毒之间的免疫关系，结果表明1 mg抗蝮蛇毒血清能中和4～5 mg各类蝮蛇毒、1 mg五步蛇毒以及1.5 mg烙铁头蛇毒和竹叶青蛇毒［14］.宜全等用小鼠实验检测了抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清对烙铁头蛇毒的中和作用，发现两种抗血清的中和效价有显著差异，但对烙铁头蛇毒中毒小鼠的保护率不存在差异［15］.郑颖等分别精制了针对国产9种蛇毒的抗血清，并检测了其与蛇毒间的免疫交叉反应，发现并非所有抗血清都具有普适性［16］.当前，对蝰科其他毒蛇免疫原性的研究报道相对较少，对于国产抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清在国产蝰科毒蛇咬伤临床治疗时的普适性评价仍有待完善.

本研究利用酶联免疫吸附检测（ELISA）和免疫印迹（western blot）两种方法，比较了国产商用抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清对国产6种蝰科小型毒蛇（亚洲蝮属：短尾蝮、乌苏里蝮和岩栖蝮；山烙铁头属：山烙铁头；原矛头蝮属：原矛头蝮；竹叶青属：竹叶青）毒素的免疫中和能力，旨在探讨这两种抗血清在蛇伤临床治疗时的适用性.

1 材料与方法

1.1 蛇毒与商用抗血清

在2008-2013年期间，分别采集实验用短尾蝮（G.brevicaudus）、乌苏里蝮（G.ussuriensis）、岩栖蝮（G.saxatilis）、竹叶青（T.stejnegeri）、山烙铁头（O.monticola）和原矛头蝮（P.mucrosquamatus）成体，带回杭州师范大学两栖爬行动物研究中心，饲养于人工气候室内，定期投饲小白鼠和泥鳅.蛇毒采集前，动物禁食1～2周，期间保证足量饮水.随后用咬膜皿法提取蛇毒，鲜毒经10 000 r／min 4 ℃离心10 min去除杂质后，真空冷冻干燥，存放于-80 ℃备用.商用抗蝮蛇毒血清和抗五步蛇毒血清购自上海赛伦生物技术有限公司.

1.2 蛋白浓度测定

以马免疫球蛋白和牛血清白蛋白作为标准蛋白，用Bradford法分别测定抗体和蛇毒的蛋白浓度，所有检测均重复3次.

1.3 酶联免疫吸附检测

将浓度为2μg／m L的6种蛇毒分别包被96孔酶标板，每孔100μL，用不含蛇毒的包被液作为对照，4 ℃包被过夜，每一反应均设置3个检测孔.用漂洗液洗去未结合蛇毒，随后各孔用2%脱脂奶粉在37 ℃封闭1 h.漂洗液洗涤后，每孔加入梯度稀释的商用抗蛇毒血清（初始质量浓度4μg／m L），37 ℃温育1 h.洗去未结合抗血清后，各孔加入HRP标记的兔抗马IgG（1∶13 500稀释），37 ℃温育1 h.漂洗液洗去未结合的酶标二抗后，各孔加入100μL底物液（含0.5 mg／m L OPD 和0.006% H2O2的0.15 mol／L 柠檬酸盐缓冲液，p H 5.0），反应20 min后加入50μL 2.5 mol／L 的硫酸终止显色.随后，用Spectra Max 384酶标仪在490 nm 下读取各孔的吸光值.

1.4 SDS-PAGE和western blot检测

蛇毒蛋白用12%分离胶进行SDS-PAGE分离.电泳结束后，用0.1%考马斯亮蓝染液染色.Western blot检测用胶经半干转印至PVDF膜（0.45μm）上，随后用5% 脱脂奶粉4 ℃封闭过夜.PVDF膜经PBS漂洗后，与适量体积的商用抗蛇毒血清（1∶1 000稀释）在37 ℃温育1.5 h.温育结束后，用PBS洗去未结合的抗血清，随后加入AP标记的兔抗马IgG（1∶2 000稀释）在37 ℃结合1.5 h.洗去未结合的二抗后，加入底物液（含0.15 mg／m L BCIP和0.3 mg／m L NBT 的0.1 mol／L Tris-HCl p H 9.5缓冲液）避光显色，最后放入去离子水中终止反应，用UMax2100扫描仪记录显色结果，并用Tan4100软件分析结果.

2 结果与分析

2.1 ELISA 检测商用抗蛇毒血清对蛇毒的免疫中和能力

利用ELISA 检测两种商用抗蛇毒血清与6种蛇毒间的免疫反应，结果显示所有检测均呈现显著的阳性效应（图1）.随着抗蛇毒血清质量浓度的升高，交叉反应的强度增加.与异物种抗蛇毒血清和蛇毒相比，同物种抗蛇毒血清和蛇毒间的免疫反应更为强烈.6种蛇毒与抗蝮蛇毒血清的免疫反应显示，短尾蝮结合力最强，乌苏里蝮与岩栖蝮次之，竹叶青、山烙铁头和原矛头蝮结合力依次减弱，且490 nm 下的OD 吸光值明显低于前3种蛇（图1a）.与抗五步蛇毒血清的免疫反应显示，相同质量浓度下亚洲蝮属3种蛇毒的抗体结合力要比与抗蝮蛇毒血清反应时低，但其结合力依然比竹叶青、山烙铁头和原矛头蝮强，后3种蛇毒的结合力减弱趋势与抗蝮蛇毒血清反应时相似（图1b）.无论使用哪种抗血清作为待检抗体，亚洲蝮属3种蛇毒的抗体结合力都比较相近.

图1 ELISA检测两种商用抗蛇毒血清与6种蛇毒免疫反应Fig.1 Cross-reaction between two commercial antivenoms and six venoms by ELISA

2.2 Western blot检测商用抗蛇毒血清对蛇毒的免疫中和能力

6种蛇毒蛋白SDS-PAGE 结果显示，短尾蝮、乌苏里蝮和岩栖蝮蛇毒的分子量分布相近，主要分布在25和45 k Da左右，在14～25 KDa之间分布较少（图2a）.Western blot检测结果显示，两种商用抗蛇毒血清和6种蛇毒之间存在不同程度的免疫交叉反应，且反应区域与蛇毒分子量条带特征相对应（图2）.

在抗蝮蛇毒血清检测组中，短尾蝮蛇毒蛋白几乎所有条带均呈现出免疫原性；岩栖蝮和乌苏里蝮有少量条带未能呈现免疫原性，这些条带主要为岩栖蝮低分子量条带（约16 k Da）和乌苏里蝮中分子区域（约34～36 k Da）.山烙铁头蛇毒的中低分子量区域（约13～40 k Da）多数条带未能与抗蝮蛇毒血清发生免疫反应，原矛头蝮蛇毒的高分子量条带（约187 k Da）和中低分子量区域（约25～41，13～22 k Da）也无法与抗蝮蛇毒血清发生免疫反应，竹叶青蛇毒高分子量区域（约196 k Da）和低分子量区域（约17 k Da）同样有少量条带不能反应.在抗五步蛇毒血清检测组中，表现出上述类似的反应性，但短尾蝮、岩栖蝮和乌苏里蝮蛇毒的反应条带较抗蝮蛇毒血清检测组少，短尾蝮蛇毒低分子量区域甚至有少量条带未能呈现出免疫原性.Western blot检测发现的蛇毒与抗蛇毒血清之间免疫反应强度的变化趋势与ELISA 检测结果相一致.蛇毒组分的免疫原性与其丰富度相关，但未发现分子量大小与免疫反应强度有关.一些蛋白条带（如短尾蝮蛇毒约20 k Da）在western blot检测中发现具有高的免疫原性，但在SDS-PAGE图谱中的含量较少；另一些蛋白条带（如竹叶青蛇毒约17 k Da、原矛头蝮蛇毒约15和18 k D）在SDS-PAGE 图谱中的含量较为丰富，但western blot却未能检测到其免疫原性.在所有抗蛇毒血清与蛇毒反应中，同物种来源的抗蛇毒血清与蛇毒间呈现最大的交叉中和效应，抗蛇毒血清与同属蛇毒间的交叉中和效应也要高于其与非同属蛇毒间的效应.

图2 Western blot检测两种商用抗蛇毒血清与6种蛇毒免疫反应Fig.2 Cross-reaction between two commercial antivenoms and six venoms by western blot

3 讨 论

蛇毒与其对应抗蛇毒血清间的免疫反应可能与蛇毒组成和含量有关，但不受分子特征的影响［17］.Dong等也发现分子大小与免疫反应之间没有直接关系［18］.本实验中，蛇毒组分的免疫原性亦不能通过SDS-PAGE结果中显示的分子大小来推测，但大部分组分都能与其对应抗蛇毒血清结合，且反应强度与组分的丰度有关.蛇毒与异种抗蛇毒血清之间的交叉反应普遍存在［17-19］.虽然构成蝰科蛇毒的蛋白种类繁多，但这些蛇毒蛋白仅属于有限的几种蛋白家族：酶（丝氨酸蛋白酶、Zn2＋金属蛋白酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A2）和非酶蛋白（解离素、C-型类凝集素、利钠肽、肌毒素、富半胱氨酸分泌蛋白、神经血管内皮生长因子、胱抑素、kunits型蛋白酶抑制剂）.尽管各蛋白家族成员的药理特性不同，但是相同蛋白家族成员有显著的结构相似性，享有共同抗原决定簇［20］.异种蛇毒既含有特异性抗原，也含有共同抗原，进而与抗血清之间表现出免疫交叉现象.

本研究中，低浓度蛇毒与抗蛇毒血清间交叉反应弱，但随着浓度的增加，反应也增强（图1）.所选取的6种蛇同属蝰科，其中短尾蝮、岩栖蝮和乌苏里蝮都属于亚洲蝮属，ELISA 和western blot的结果均显示这3种蛇毒与抗蛇毒血清之间的免疫交叉反应强度明显高于竹叶青、山烙铁头和原矛头蝮，表明在近缘物种间，其蛇毒与抗蛇毒血清间交叉反应强度更高，这与蛇毒间具有较多的共同抗原有关.种系发生和蛇毒组分之间的关系之前也有文献报道［21-22］，然而也有研究显示出同一属内蛇毒组分的变异［23-24］.最近，Gibbs等对Sistrurus属物种的研究发现，并无证据能表明蛇毒变异与种系发生之间有显著的相关性［25］.Sousa等就拉丁美洲矛头蝮属6种蛇的种系发生、蛇毒组成和抗蛇毒血清对其免疫中和效果进行了比较分析，结果也表明蛇的分类地位和蛇毒组成的关联较低［10］，进而推测蛇毒组成的变异应受到食性差异的显著影响.

抗蛇毒血清的生产与使用，需要精确的临床前实验及临床评估，以保证其有效性和安全性.一系列实验室方法已经被用来测定抗蛇毒血清对某种蛇毒相关性最高的毒性的中和能力［26］.但从现有的研究结果看，并不能单纯地依据种属关系来选用和制备抗血清，依据蛇毒中起主要免疫作用的蛋白家族来选用抗血清似乎更合理.本实验中，短尾蝮、岩栖蝮和乌苏里蝮免疫原性比较接近，可能是其金属蛋白酶含量比较相近.抗蝮蛇毒血清对短尾蝮、乌苏里蝮和岩栖蝮蛇毒的免疫中和效价要高于抗五步蛇毒血清，在实际治疗这3种毒蛇咬伤时，应优先选择抗蝮蛇毒血清；两种抗蛇毒血清中和山烙铁头、原矛头蝮和竹叶青蛇毒的能力相近，在实际治疗这3种毒蛇咬伤时，可随机选择这两种抗蛇毒血清，另一种途径是制备这3个物种针对性抗蛇毒血清.

综上，尽管两种抗蛇毒血清分别由单一蛇毒免疫制备而成，但由于这些蛇毒与近缘物种蛇毒组分的抗原决定簇间具有不同程度的相似性，因此抗血清与异种蛇毒间可以发生免疫反应.在国内尚无针对上述蝰科所有毒蛇抗蛇毒血清的情况下，本研究对于临床治疗上述6种毒蛇咬伤时抗蛇毒血清的选择无疑具有重要指导意义，还可为抗蛇毒血清制备策略的完善提供参考.

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