无血清诱导脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的实验研究

张秀霞，蒋良福

(1.温州医科大学附属第二医院急诊科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第二医院手外科，浙江 温州 325027)

雪旺细胞作为周围神经组织工程的种子细胞在周围神经再生中的重要作用已被广泛证实，诱导间充质干细胞向雪旺细胞的分化是目前研究的热点，已有从骨髓基质干细胞、脂肪间充质干细胞诱导转化为雪旺细胞的报道[1，2]。将诱导后的雪旺细胞作为种子细胞移植入的是一个无血管供血的体内环境。本实验将模拟体内环境，探讨在无血清培养下将脂肪间充质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性，为以后的脂肪间充质干细胞向雪旺细胞的体内诱导分化提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 近交系SD大鼠10只，清洁级，体重180～200g，2月龄，雌雄不限，由温州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 0.1%Ⅰ型胶原酶(sigma，美国)，10%胎牛血清(碧云天公司，杭州)，DMEM/F12培养基(Gibco，美国)，100X青链霉素，β-巯基乙醇(sigma，美国)，全反式维甲酸(sigma，美国)，forskolin(Peprotech，英国)，碱式成纤维生长因子(basic fibrgblast growth factor，bFGF，Peprotech，英国)，血小板源性衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF，Peprotech，英国)，神经胶质生长因子(glial growth factor，GGF，Peprotech，英国)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪间充质干细胞分离培养 采用Zuk等[3]的方法分离大鼠脂肪间充质干细胞并培养。2个月龄SD大鼠麻醉后取双侧睾丸周围脂肪组织，去除肉眼可见血管以及结

基金项目：浙江省自然科学基金资助(Y2100253)；温州市科技计划项目(Y20130203)；*本文通讯作者：蒋良福

缔组织，剪成约1 cm×1 cm×1 cm大小，0.1%Ⅰ型胶原酶震荡消化60 min，等体积DMEM/F12终止消化，200目筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀用含15%胎牛血清的DMEM/F12重悬并接种于25 cm2培养瓶中。48 h换液去除未贴壁细胞，每3天换液。取第三代脂肪间充质干细胞行倒置显微镜形态学观察、CD44、CD90和CD45流式细胞仪鉴定细胞表面标志

1.2.2 分组 将第3代大鼠脂肪干细胞分为实验组及对照组，实验组予无血清培养基(100%DMEM/F12)诱导培养，对照组继续DMEM/F12完全培养基(90DMEM/F12+体积分数10%FBS)诱导培养。

1.2.3 大鼠脂肪间充质干细胞向雪旺细胞诱导方法 将2组细胞消化计数，吹打分散成单个细胞悬液后接种于25 cm2培养瓶，24 h后分别加入含1 mmol/Lβ-巯基乙醇的培养基，24 h后PBS清洗，加入含40 ng/mL全反式维甲酸的培养基，培育72 h去除培养基，PBS清洗，加入含5 ng/mL PDFG，10 ng/mL bFGF，14 μmol/L forsklin，200 ng/mL GGF的培养基中培育2周，期间3天换液一次。

1.3 观察指标 脂肪间充质干细胞倒置显微镜下形态学观察。脂肪间充质干细胞CD90和CD44、CD45流式鉴定。诱导形态观察：诱导后2周倒置显微镜下观察诱导脂肪间充质干细胞形态学变化。S-100和GFAP免疫荧光细胞化学染色：诱导脂肪间充质干细胞诱导后细胞爬片，铺满后4%多聚甲醛固定，各组细胞封闭、一抗、二抗孵育，封片后倒置荧光显微镜下观察并计算阳性率。

2 结 果

原代脂肪间充质干细胞呈成纤维样细胞，贴壁生长。流式细胞仪鉴定细胞表面标记，间充质干细胞相关的CD90和CD44表达阳性，而造血细胞相关的CD45表达阴性(见图1～3)。2组第三代脂肪间充质干细胞经诱导后，大部分细胞成梭形，长出两极突起，突起带有光晕，各相邻细胞突起之间相互连接，成树杈状排列(图4～5)。经S-100和GFAP免疫荧光染色后，2组大量细胞的S-100和GFAP免疫荧光细胞染色阳性，实验组S-100阳性率(82.1±5.31)%，对照组S-100阳性率(79.15±6.38)%，比较无明显差异(P>0.05)，实验组GFAP阳性率(78.39±6.92)%，对照组GFAP阳性率(80.51±3.29)%，比较无明显差异(P>0.05)，(见图6～9)。

3 讨 论

雪旺细胞具有营养神经、趋化和使周围神经再生轴突成熟的重要功能，在修复周围神经缺失的过程中具有重要的作用。脂肪间充质干细胞是近年来较热门的种子细胞，人体脂肪组织含量丰富，容易提取，且大量研究表明脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能[4，5]。国内外学者都曾报道了将脂肪间充质干细胞诱导成雪旺细胞的研究。但目前没有模拟移植初期体内的缺血环境，因此本实验用无血清的培养基模拟体内的缺血环境，将脂肪间充质干细胞诱导分化为雪旺细胞。

图1 CD90流式细胞表型鉴定阳性

图2 CD44流式细胞表型鉴定阳性

图3 CD45流式细胞表型鉴定阴性

图4 倒置显微镜下无血清培养诱导后雪旺细胞(×100)

图5 倒置显微镜下含血清培养诱导后雪旺细胞(×100)

图6 试验组S-100细胞免疫荧光(×100)

图7 对照组S-100细胞免疫荧光(×100)

图8 试验组GFAP细胞免疫荧光(×100)

雪旺细胞来源于神经嵴细胞，再由神经嵴细胞经雪旺细胞前体、未成熟的雪旺细胞，最后发育为神经细胞。β-巯基乙醇能提高细胞内的c-AMP水平，适量浓度的β-巯基乙醇可以促进间充质干细胞向神经细胞分化[6]，全反式维甲酸能促进早期的神经细胞向神经嵴细胞分化，同时能促进细胞有丝分裂[7，8]。PDFG，bFGF，forsklin，GGF是可以促进神经细胞向周围神经分化以及成熟，并提高对神经营养因子的应答的细胞因子，在使用全反式维甲酸诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞后，应用PDFG，bFGF，forskllin，GGF，细胞体形更加两极化，并出现光晕，成树杈状排列，符合雪旺细胞的形态学改变。

图9 对照组GFAP细胞免疫荧光(×100)

S100和GFAP是雪旺细胞富含的蛋白，是鉴定雪旺细胞的常用指标。本实验在无血清培养条件下，采用逐步诱导的方法，将脂肪间充质干细胞逐步诱导为雪旺细胞。经细胞免疫荧光鉴定符合雪旺细胞特性，与血清培养条件下比较，在形态学和细胞免疫荧光鉴定阳性率无明显差异。

脂肪间充质干细胞在无血清培养条件下，能定向诱导分化为雪旺细胞。

参考文献：

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[2]胡军，刘小林，朱家恺，等.体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化[J].中华创伤骨科杂志，2004，6(5)：538-541.

[3]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，etal.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7(2)：211-228.

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[5]Strem BM，Hicok KC，Zhu M，etal.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Keio J Med，2005，54(3)：132-141.

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[7]Dezawa M，Takahashi I，Esaki M，etal.Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells[J].Eur J Neurosci，2001，14(11)：1771-1776.

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