胰腺癌与糖尿病、胃肠道微生态和microRNAs关系的研究现状

何相宜 袁耀宗

上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科(200025)

胰腺癌(胰腺外分泌癌)是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其发病率在全球范围内逐年上升。2010年，美国胰腺癌新发病例数为43 140例，占恶性肿瘤的第十位，而死亡率却高居第四位，死亡病例数为36 800例[1]。我国胰腺癌发病率也呈逐年上升趋势，近20年来发病率增长约6倍，其发病率已占恶性肿瘤的第七位，病死率位居第六位。虽然近年来在胰腺癌治疗上取得了一定的进展，然而手术仍是惟一可提供潜在治愈机会的治疗手段。但大多数胰腺癌发现时已失去手术机会，且对化放疗、靶向治疗效果有限，故生存率仍低。本文围绕胰腺癌与糖尿病、胃肠道微生态、microRNAs(miRNAs)在胰腺癌中的作用这三个方面进行探讨，寻找可能提高胰腺癌早期诊断的方法，挖掘治疗胰腺癌的潜在靶点。

一、胰腺癌与糖尿病

近来多项研究证实，糖尿病与胰腺癌的发生、发展密切相关。长期糖尿病是胰腺癌的发病因素之一，而新发糖尿病则是胰腺癌的表象。流行病学研究[2]显示，长期糖尿病患者患胰腺癌的风险增加，相对危险度为1.5～2.0。新发糖尿病或血糖控制不佳则可能是胰腺癌的早期表现，即胰腺癌可能诱导了新发糖尿病的出现或使原有糖尿病病情加重，主要有以下证据支持：①新发糖尿病者发生胰腺癌风险高，且明显高于长期糖尿病者。Kuang等[3]和Magruder 等[4]发现，新发糖尿病和(或)最近开始接受胰岛素治疗的糖尿病患者发生胰腺癌的危险性最高，而长期糖尿病患者发生胰腺癌的风险仅呈中等程度升高。笔者课题组与上海第二军医大学长海医院的合作也得到了相似结果[5]，研究共纳入1 458例胰腺癌患者和1 528例对照，多因素分析显示，与对照组相比，长期糖尿病与新发糖尿病患者发生胰腺癌的相对危险度分别为2.11和4.43。②胰腺癌相关糖尿病大多为新发糖尿病。Pannala等[6-7]的研究显示，约40%的胰腺癌确诊病例同时存在高血糖或糖尿病，若将葡萄糖耐量异常者纳入后则接近80%，其中大多数为36个月内的初发糖尿病。笔者等[8]的研究亦取得了相似结果，即44.7%的胰腺癌患者伴有糖尿病，其中2/3为新发糖尿病。③部分胰腺癌患者在接受手术治疗后，糖尿病或糖耐量异常情况有所好转。来自笔者和其他研究者的数据分析[7-9]显示，胰腺癌切除术后，41%～57%的术前伴新发糖尿病患者血糖可恢复，而长期糖尿病者术后血糖则无明显改善。

由于在人群中胰腺癌的发病率偏低，且缺乏特异性标记物，因此开展大规模普查不太现实。如能确定胰腺癌的高危人群，缩小筛选成本，选择合适的筛查手段将具有临床应用价值和效益成本。由于有以上众多证据的支持，许多学者提出可将新发糖尿病作为早期诊断胰腺癌的线索[6]。但目前尚缺乏以新发糖尿病为高危人群筛查胰腺癌的人群研究，故仍无法肯定该价值。然而目前新发糖尿病患者增加，且是一个庞大的群体，如能再结合其他高危因素，如家族史、胰腺炎等则有可能建立更为有效的筛选模型。

除了有助于早期诊断，近年来多项研究还报道了糖尿病对胰腺癌预后的影响，但结论尚有争议。多数研究[10-11]提示，胰腺癌伴糖尿病患者预后较差，少数研究提示，糖尿病状态与胰腺癌预后无关，甚至伴糖尿病患者预后更佳[10]。笔者课题组进一步研究[8]发现，不同状态糖尿病对于胰腺癌术后各方面有不同的影响。长期糖尿病是胰腺癌术后预后不良的因素，而新发糖尿病术后血糖恢复则为预后保护因素，但其机制尚未完全明了。

抗糖尿病药物也可能对胰腺癌的进展起作用，其可能会改变胰腺癌的风险。以往回顾性分析提示，胰岛素应用可能增加胰腺癌风险，二甲双胍应用则可能减低风险，其机制可能为二甲双胍破坏了胰岛素受体和G蛋白偶联受体(GPCRs)信号通路[12]。笔者课题组通过分析二甲双胍处理前后胰腺癌细胞miRNAs表达谱的变化，发现二甲双胍上调miR-26a可有效地抑制胰腺癌细胞的生长[13]。而最近一项meta分析[14]显示，服用磺脲类药物使糖尿病患者发生胰腺癌的风险上升了70%，而其他抗糖尿病药物不影响胰腺癌患病风险。

迄今为止，糖尿病与胰腺癌致病机制的关系尚未完全明了。糖代谢异常促进胰腺癌发生发展的机制可能包括糖代谢异常引发的血糖升高，外周胰岛素抵抗和高胰岛素血症，异常胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)受体通路活化，氧化应激与炎症反应等，从而抑制肿瘤细胞凋亡并促进其增殖[2]。笔者课题组通过比较伴与不伴糖尿病的胰腺癌患者组织中蛋白表达差异谱发现，胰腺再生蛋白(REG)Iα在伴有糖尿病的胰腺癌组织中表达明显增高，且与肿瘤大小呈正相关。进一步的体内、外实验证实，REG Iα可促进胰腺癌细胞的增殖，并提高其成瘤性[15]。REG Iα是一种调节胰岛β细胞的生长因子，不仅参与炎症反应，而且还与诸多胃肠道肿瘤的发生有关。因此推测REG Iα可能在胰腺癌与相关糖尿病的致病过程中起一定作用，可能成为胰腺癌伴糖尿病的潜在治疗靶点[16]。

新发糖尿病可能有助于早期诊断胰腺癌，而抗糖尿病药物的不同选择可能影响胰腺癌发生率，对糖尿病促进胰腺癌分子机制的研究也有利于寻找胰腺癌治疗新靶点。

二、胰腺癌与胃肠道微生态

存在于消化道中的正常微生物构成的微生态环境是人体抵御疾病的重要屏障。在各种疾病，特别是消化道病变后胃肠道菌群常常发生变化，并影响疾病进程。胃肠道微生态与胰腺癌的关系也正日益被人们认识。

人口腔内含有700多种细菌，口腔微生态不仅与口腔肿瘤相关，与胃肠道肿瘤亦相关。Farrell等[17]报道：利用人类微生物识别芯片结合16S rRNA-PCR技术检测胰腺癌(n=28)、慢性炎腺炎(n=27)和健康志愿者(n=28)，发现胰腺癌患者的口腔菌群组成与慢性胰腺炎和健康志愿者显著不同，包含链球菌、普氏菌、弯曲杆菌、奇异菌属、奈瑟氏菌等，提示上述细菌可能参与胰腺癌的发病，并可用于胰腺癌的早期诊断。口腔菌群参与胰腺癌的发病机制可能为异常的口腔菌群能将乙醇转化为致癌物甲醛，也可引起炎症反应，影响机体免疫应答，参与癌症发生。

幽门螺杆菌(Hp)感染也是胰腺癌的高危因素。meta分析[18]显示，Hp感染罹患胰腺癌的相对危险度为1.47(95%CI:1.22～1.77)。致癌物亚硝酸盐的产生以及全身免疫反应可能是Hp感染与胰腺癌相关联的机制[19]。肠道菌群与胃肠道肿瘤密切相关，大肠肠道菌群与多种肠道外癌症包括肝癌、乳腺癌亦相关。在小鼠大肠中定植的肝原螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus)可通过诱发天然和辅助性T细胞(Th)1型获得免疫以及激活细胞核因子(NF)-κB通路从而诱发肝脏癌变。此外，肠道微生态的改变可导致宿主肥胖症、胰岛素抵抗和糖尿病的发生，而肥胖和糖尿病是肝癌和胰腺癌的确定危险因素。近期一项利用高脂饮食诱导小鼠肝癌模型的研究[20]发现，肥胖导致小鼠某些肠道微生态失调，某些肠道细菌代谢胆汁的副产物—去氧胆酸明显升高，进而导致肥胖鼠相关肝癌的发病率增加。肥胖患者是否通过肠道菌群紊乱引起某种或几种代谢产物失调而导致胰腺癌发病增加，值得进一步研究。

胰腺癌相关胃肠道微生态改变对临床应用亦有重要启发。如口腔菌群检测可提高胰腺癌的早期诊断，改变口腔菌群是否可以起预防肿瘤发生的作用以及是否可以改变某些抗癌药物反应、Hp感染对胰腺癌的发生发展是否有影响、抗Hp治疗是否对胰腺癌具有保护性作用、肠道菌群与胰腺癌的关系、检测肠道菌群是否可以诊断胰腺癌、调节肠道菌群是否对胰腺癌的预后产生影响，这些问题有待进一步探讨。

三、胰腺癌与miRNAs

miRNAs是一类高度保守的含18～24个碱基的小RNA分子家族。miRNAs调控靶mRNA的稳定性和转录活性，参与细胞的生物学功能。目前已鉴定出数十个miRNAs参与了胰腺癌的增殖、转移以及化疗的敏感性[18]，且数目还在不断增加。联合多个miRNAs的检测可区分胰腺癌与其他良性胰腺疾病，评价疾病预后和对化疗的敏感性，是潜在的治疗靶点。在胰腺癌中起“癌基因”作用的miRNAs如：miR-155靶向关键抑癌基因TP53INP1[21]；miR-21参与胰腺癌细胞的增殖转移，还可通过减低SMAD7的表达, 激活TGF-β通路[22]，参与基质形成引起化疗耐药；miR-224 和 miR-486 在高转移的胰腺癌中高表达，靶向CD40，逃避肿瘤免疫；miR-132和miR-212靶向pRb，增加E2F活性，促进胰腺癌细胞增殖；miR-27a靶向抑癌基因DPC4/Smad4，促进胰腺癌细胞增殖、克隆形成和迁移；miR-10a/b在胰腺癌中高表达，促进胰腺癌侵袭，其可能的靶基因为HOX。而在胰腺癌中起“抑癌基因”的如：miR-200a/b/c家族通过抑制SIP1、ZEB1以及干细胞因子如Sox2抑制胰腺癌细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭[23]；miR-375靶向14-3-3 Zeta诱导Caspase依赖的凋亡[24]；miR-130b在胰腺癌中低表达，是胰腺癌的独立预后保护因素，其可能通过STAT3抑制胰腺癌细胞的增殖[25]；高表达miR-96诱导胰腺癌细胞凋亡，抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭。此外，miRNAs还参与放化疗的敏感性，如miR-23b在放疗耐受胰腺癌细胞中高表达，上调miR-23b使细胞对放疗敏感，可能的作用机制与ATG12蛋白和自噬相关。

这些miRNAs在胰腺癌中作用的揭示将对临床有两个方面重要意义，其一，是以miRNAs作为治疗靶点，通过调节miRNAs水平直接达到抑制肿瘤，或促进放化疗敏感性的目的。目前miRNAs的类物(mimics)和抑制物在实验中广泛应用，但尚缺乏稳定的临床可用制剂。有研究采用纳米材料运输miRNAs有一定的应用前景，但仍有待于进一步临床验证其安全性和有效性。其二，miRNAs作为肿瘤标记物已被广泛关注。

从外周血中检测肿瘤标记物方便易行，始终是胰腺癌早期诊断研究的热点之一。miRNAs在循环血液中稳定表达，且目前有多种检测方法，敏感性高，对于微量miRNAs亦能定量，目前认为miRNAs在胰腺癌发生的早期阶段即已出现异常表达。有研究[26-27]显示，miRNAs在胰腺癌癌前病变胰腺腺管内上皮瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia)中异常表达。目前，采用高通量或其他手段已鉴定出循环miR-21[28-29]、miR-155[28]、miR-16[30]、miR-196a[30]、miR-1290[31]、miR-221[32]、miR-375 (胰腺癌中低表达)[32]、miR-18a[33]等单独或组合或联合CA19-9是潜在的胰腺癌标记物[29-30]。一项meta分析[28]汇总了三项血液学miRNAs的研究，提示miRNAs在胰腺癌中的中位敏感性和特异性分别为0.91和0.96。2014年JAMA发表了一项有关在胰腺癌患者全血中检测miRNAs标记物的研究[34]，比较409例胰腺癌、25例慢性胰腺炎和312名健康对照者全血中miRNAs表达谱差异。与正常对照相比，筛选出38个miRNAs在胰腺癌中异常表达，并建立两个检测模型分别为基于4个miRNAs (miR-145、miR-150、miR-223、miR-636)模型Ⅰ和基于10个miRNAs(miR-26b、miR-34a、miR-122、miR-126*、miR-145、miR-150、miR-223、miR-505、miR-636、miR-885.5p)模型Ⅱ。模型Ⅰ和Ⅱ的训练队列中ROC曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性分别为：0.86(95%CI：0.82～0.90)、0.85(95%CI：0.79～0.90)和0.64(95%CI：0.57～0.71)；0.93(95%CI：0.90～0.96)、0.85(95%CI：0.79～0.90)和0.85(95%CI：0.80～0.85)。如与CA19-9联合能显著提高模型Ⅰ的AUC，在早期(Ⅰ和Ⅱ期)胰腺癌中均能达0.80以上。笔者所在课题组与南京大学生命科学院合作以Illumina合成测序筛选并续以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证的方法对比97例胰腺癌和158例年龄性别配对的无瘤对照者的血清miRNAs，建立了基于miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185和miR-191七个miRNAs联合检测模型，能有效鉴别胰腺癌与胰腺炎(AUC=0.993)，且诊断胰腺癌的准确率(86.8%)明显高于CA19-9(76.0%)和癌胚抗原(CEA)(55.8%)。令人欣喜的是，我们发现在26例Ⅰ期胰腺癌患者中, miRNAs模型标记的阳性率是96.2%，较CA19-9(46.2%)或 CEA(30.8%)均显著升高，而在48 例Ⅱ期胰腺癌中, 阳性率为91.7%,亦较CA19-9(62.5%)或 CEA(31.3%)高[29]。提示miRNAs在早期胰腺癌检测中更有价值，有助于提高早期胰腺癌诊断率。

除了血液中miRNAs，胰腺癌患者其他体液中亦可检测到miRNAs的异常表达。有研究发现在胰腺癌癌前病变胰腺导管内乳头状瘤(intraductal papillary mucinous neoplasms)患者的胰液中, miR-155、miR-21较对照组显著升高[21]。另有研究显示，唾液的转录组[35]、粪便中突变K-RAS的检测[36]以及尿液代谢组[37]也可能是胰腺癌的标记物。相对于胆汁和胰液，唾液、尿液、粪便等更易于收集。其他体液是否存在可检测的差异miRNAs作为胰腺癌标记物还有待研究。我们课题组也正在进行胰腺癌患者唾液中miRNAs作为诊断标记物的研究。尽管目前miRNAs的检测和靶向治疗并未应用于临床，但我们有理由相信在不久的将来miRNAs 将会给胰腺癌诊断和治疗提供有益的帮助。

总之，对胰腺癌与糖尿病、胃肠道微生态和miRNAs关联机制的研究有助于我们寻找早期诊断胰腺癌的方法，如新发糖尿病作为胰腺癌高危人群筛查、肠道微生态变化诊断早期胰腺癌、血清miRNAs作为诊断标记物等，也有助于寻找治疗胰腺癌靶点，如干预糖尿病胰腺癌联系结点蛋白(REG Iα等)、干预胰腺癌相关miRNAs、调节胃肠道菌群等，都值得我们进一步探究，并期待应用于临床。

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