三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析*

邱锡尔 朱冬发 崔晓雨 汤 洁 谢 熙

(宁波大学海洋学院 宁波 315211)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus), 隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portunus)。近年来三疣梭子蟹在人工养殖过程中存在性早熟和蜕皮未遂等问题,严重影响蟹的正常生长, 导致养殖效益下降(刘昌杰等, 1999)。早期幼蟹发育过快、蜕皮次数过频是导致养殖蟹类性早熟的重要原因之一(邱高峰等, 2003)。

催化乙酰辅酶A生成甲羟戊酸是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGR)的主要功能。因甲羟戊酸的生成不可逆, HMGR被认为是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶, 是细胞质萜类化合物合成的重要调控点。在哺乳动物细胞中, 甲羟戊酸途径产生的重要产物是胆固醇, 调控HMGR活性可以有效控制类固醇含量 (Chenet al, 2012); 在植物细胞质中, HMGR通过次生代谢合成的许多倍半萜和三萜类化合物具有药理活性。昆虫通过甲羟戊酸途径合成保幼激素JH、聚集素和警戒素等萜类物质。由于HMGR在甲羟戊酸途径中的重要功能, 昆虫、植物、哺乳动物等许多物种的HMGR基因已见报道, 例如细纹豆芜菁(Epicauta mannerheim)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)、高山象白蚁(Nasutitermes takasagoensis)、小家鼠(Mus musculus)、橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)等(Getleret al, 1988; Sundaresanet al, 1989; Kinjohet al, 2007; Hojoet al, 2012;王启超等, 2012; 姜鸣等, 2012)。但在甲壳动物上仅见于美洲海鳌虾(Homarus americanus) (Liet al, 2003;Liet al, 2004)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)(NCBI登录号: GU969105.1, 仅为部分序列)。

甲壳动物通过甲羟戊酸途径合成甲基法尼酯(Methyl farnesoate, MF)。MF是一种倍半萜类激素,在昆虫体内经环氧化可生成保幼激素JHⅢ(Juvenile hormone Ⅲ, JHⅢ), HMGR是MF合成路径初始步骤的关键限速酶(Katherineet al, 2011)。MF首先发现于蜘蛛蟹(Libinia emarginata)的血淋巴(Lauferet al,1987); 随后的研究显示大颚器(mandibular organ, MO)是合成和分泌甲基法尼酯的唯一器官(李胜等, 2000)。MF与甲壳动物的生殖繁育、蜕皮、形态建成、渗透压调节、习性和多数蛋白质合成等生理活动的调控有关(Sorokaet al, 2000; Lovettet al, 2001; Lauferet al,2002, 2005;), 受眼柄中多肽类激素大颚器抑制激素(Mandibular organ inhibiting stimulating hormone,MOIH)的负调控(Wainwrightet al, 1996)。

蜕皮是甲壳动物蜕去旧的外骨骼, 个体增大后新甲壳迅速硬化为外骨骼的过程。多数研究结果表明MF能够促进蜕皮发生, 罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)蜕皮周期中血淋巴MF浓度和蜕皮激素浓度一样呈周期性变化, 且早一步达到最高峰值, 说明MF可能通过促进蜕皮激素的合成来调控蜕皮发生(Wilderet al, 1995); 外源MF能够促进红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)蜕皮(Abduaet al, 2001), 蜕皮前期色拉淡水蟹(Oziotelphusa senex senex)的离体大颚器较其他各期能分泌更多的MF(Nagarajuet al,2006)。

HMGR是MF合成途径第一步中的限速酶, 对于阐明MF的作用机制来说极具研究价值。本文研究以三疣梭子蟹(P. trituberculatus)为材料, 进行HMGR基因全长cDNA克隆、组织差异性表达以及在蜕皮周期中表达水平的变化分析。研究结果将有助于阐明甲壳动物蜕皮的调控机制和解决养殖过程中遇到的蜕皮过频和蜕皮未遂等问题。

1 材料与方法

1.1 材料

取头胸甲宽(CW)为8—12cm、体重(BW)为45—80g的野生三疣梭子蟹, 雌雄各半, 在宁波市宁海得水育苗场进行暂养及采样。利用形态观察法将三疣梭子蟹蜕皮周期分为蜕皮后期(A、B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亚期)和蜕皮期(E)共四个阶段(沈洁等, 2011)。解剖取C期三疣梭子蟹眼柄、心脏、肌肉、胸神经节、精巢、卵巢、肝胰腺、鳃、MO和Y器(Y-organ, YO)用于组织表达差异分析; 采集各期(E期除外)三疣梭子蟹MO组织进行蜕皮周期中HMGR基因表达水平变化的分析。蜕皮周期各期选取3只蟹做平行实验, 解剖获得的组织转移至RNA保护液(生工生物工程(上海)有限公司)–20°C保存, 用于提取总RNA。

1.2 总RNA提取

将上述存于RNA保护液中的样品转移至Trizol(生工生物工程(上海)有限公司)溶液中, 按说明书所述步骤提取各个样品中的总RNA, 经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。提取Total RNA后, 再使用DNaseⅠ消除基因组DNA的干扰, 最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等进行纯化。

1.3 三疣梭子蟹HMGR基因的全长克隆及序列分析

1.3.1 cDNA的合成 取新鲜解剖获得的MO总RNA, 用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time, Takara)试剂盒反转录得到第一链cDNA; 用于3′-RACE扩增的3′-RACE-cDNA以AP(表1)为接头引物, 用与上述相同的方法反转录获得; 用于5′-RACE扩增的5′-RACE-cDNA按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书合成。所有cDNA均置于–20°C下保存备用。

1.3.2 RT-PCR 根据已公布的甲壳动物和昆虫的HMGR氨基酸序列高保守区域, 利用Block Maker软件设计兼并引物HMGR-F和HMGR-R(表1)。以第一链cDNA为模板, HMGR-F和HMGR-R为上下游引物进行PCR扩增, 总体系为25μL。扩增条件: 94°C 预变性5 min; 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 34个循环;72°C 充分延伸10min, 反应结束。

1.3.3 三疣梭子蟹HMGR基因的3′-RACE和5′-RACE扩增 根据首轮RT-PCR的测序结果设计特异性上游引物GSP3-1和GSP3-2(表1)。以3′-RACE-cDNA为模板, GSP3-1及outer primer-3′(表1)为上下游引物进行第一轮3′-RACE扩增, 总体系为25μL。扩增条件: 94 °C 预变性4 min; 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 1min30s, 34个循环; 72°C 延伸10 min。第二轮3′-RACE扩增以第一轮产物为模板, GSP3-1和inner primer-3′为一对引物, 体系同上。扩增条件:94°C 预变性4min; 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 1min30s,34个循环; 72°C 延伸10min。

根据首轮RT-PCR的测序结果设计特异性下游引物GSP5-1和GSP5-2(表1)用于5′-RACE扩增。按5′-Full RACE kit试剂盒说明书操作进行巢氏PCR:第一轮PCR以5′-RACE-cDNA为模板, outer primer-5′和GSP5-1为上下游引物进行扩增, 扩增体系:94°C 预变性3min; 94°C 30s, 51°C 30s, 72°C 1min,34个循环; 72°C延伸10min。第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板, inner primer-5′和GSP5-2为上下游引物进行PCR扩增, 扩增体系: 94°C 预变性3min; 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 1min, 34个循环;72°C延伸10min。

表1 PCR引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers used for PCR

1.3.4 PCR产物的克隆与测序 PCR产物经琼脂糖电泳后, 进行回收和连接, 转化至E.coliDH5α感受态细胞进行培养, 选取阳性克隆菌菌液送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.3.5 序列分析 利用Vector NTI 10.0对测序结果进行初步的分析和拼接, 获得三疣梭子蟹HMGR基因的全长cDNA序列。在NCBI上利用在线ORF Finder确定其开放阅读框(ORF)序列, 并翻译成氨基酸序列, 利用ExPASy Proteomics Server (http: //ca.expasy.org/)所提供的多种蛋白质在线软件对氨基酸序列进行蛋白预测分析; 用Signal 3.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP)预测氨基酸序列信号肽; 利用在线TMHMM工具(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)预测氨基酸跨膜区域;利用ClustalX软件将该氨基酸序列与已公布的HMGR氨基酸序列进行同源性比对分析, 并用MEGA 4.0软件的邻位法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。

1.4 实时荧光定量PCR

将取好的样品按照1.2的方法进行抽取总RNA,取1.0μg的总RNA用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒进行反转录; 然后运用实时荧光定量的方法对HMGR基因在三疣梭子蟹不同组织及蜕皮周期各期的表达水平差异进行分析。根据该基因的cDNA序列设计荧光定量引物YG-F和YG-R(表1), 以β-actin作为内参。PCR反应条件: 95°C 2min; 95°C 5s、57.3°C 20s、68°C 30s, 共40个循环; 95°C 15s、55°C 15s、95°C 15s。SPSS17.0软件对数据进行分析处理。

2 结果

2.1 三疣梭子蟹HMGR基因cDNA全长与序列分析

图1 三疣梭子蟹HMGR基因全长cDNA核苷酸序列和编码区氨基酸序列Fig.1 The cDNA and amino acid sequences of gene encoding HMGR from P. trituberculatus

用兼并引物HMGR-F和HMGR-R进行PT-PCR得到的产物, 经测序及分析后获得951bp的核心片段。用引物GSP3-1和outer primer-3′, GSP3-2和inner primer-3′进行3′RACE, 测序及分析后获得1163bp的3′端片段。用引物GSP5-1和outer primer-5′, GSP5-2和inner primer-5′进行5′RACE, 测序及分析后获得461bp的5′端片段。对以上片段进行拼接后获得总长为2575bp的HMGR基因cDNA全长(图1), GenBank登录号: KF280756。5′端非编码区为53bp, 3′端非编码区为686bp, 开放阅读框(ORF)长度为1836bp, 编码611个氨基酸。利用ExPASy网站在线ProtParam tool预测其分子式为C2821H4584N794O882S37, 分子量大小约为64.9kD, 预测等电点为6.52, 富含Val(10%)、Ser(9.5%)、Ala(9.3%)、Leu(8.5%)、Gly(7.7%)和Pro(7.0%)等, 预测蛋白含负电荷氨基酸残基60个(Asp+Glu), 正电荷氨基酸残基57个(Arg+Lys)。不稳定系数为54.03, 说明三疣梭子蟹HMGR蛋白并不稳定。该氨基酸亲水性总和GRAVY (Grand average of hydropathicity)为-0.106, 属于亲水性蛋白。

利用在线Signal软件(http: // www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)对其编码区氨基酸序列进行分析,未发现有信号肽, 说明三疣梭子蟹HMGR不属于分泌蛋白。在线TMHMM工具分析发现该氨基酸序列没有跨膜结构。NCBI在线Conserved Domain Search工具对氨基酸序列进行结构域分析, 发现在氨基酸80—484区域为Ⅰ型HMGR保守催化区。经ExPASy网站在线Motif Scan工具对三疣梭子蟹HMGR氨基酸进行功能结构域分析, 发现该蛋白可能存在6个蛋白酶C磷酸化位点, 8个N-豆蔻酰化位点, 8个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)位点, 2个酰基化位点和3个N-端糖基化位点。经比对发现三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列中, 有两个HMG-CoA 结合基序和两个NADP(H)结合基序, 是Ⅰ型HMGR的典型区域。

在NCBI上将该序列编码区氨基酸序列进行BLAST搜索比对, 发现与已公布的其它物种HMGR氨基酸序列相比: 与美洲海鳌虾(H.americanus)HMGR的氨基酸序列一致性最高, 与其两种亚型的一致性均为65%。由于对甲壳动物中HMGR基因的研究较少, 与部分昆虫和脊椎动物的HMGR氨基酸序列进行比对发现: 与高山象白蚁(N. takasagoensis)和褐飞虱(Nilaparvata lugens)的一致性分别为62%、61%, 与小家鼠(M. musculus)、原鸡(Gallus gallus)、智人(Homo sapiens)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的一致性分别为63%、63%、62%、59%。

用ClustalX软件将美洲海鳌虾的两条HMGR亚型氨基酸序列(HaHMGR1和HaHMGR2)与本研究获得的三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列(PtHMGR)进行比对(图2)。结果表明在重要结构域方面, 它们均有两个HMG-CoA 结合基序: EN(V/I)VGYMP(V/I)P和TTEGCLVA; 两个NADP(H) 结合基序: DAMGMNM和GTVGGGT。

从NCBI蛋白序列数据库中选取具有代表性的各类物种(甲壳动物、昆虫、脊椎动物、植物)HMGR氨基酸序列, 以细菌为外群用MEGA 4.0软件的邻位法(Neighbor-Joining)构建系统进化树, 设置重复次数(Replications)为1000(图3)。从进化树结果来看,HMGR氨基酸序列根据种属被划分为动物和植物两大类, 三疣梭子蟹与美洲海鳌虾同属甲壳类, 聚为一支, 亲缘关系最近; 甲壳动物、昆虫与脊椎动物聚为一大分枝, 但是甲壳动物的HMGR与脊椎动物亲缘关系甚于昆虫。

2.2 HMGR基因在三疣梭子蟹不同组织中的表达差异分析

对qRT-PCR的数据进行分析, 结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达。在MO中表达量极高, 在其它组织中表达量极低, 差异极显著(P<0.01), 且雌雄三疣梭子蟹的组织表达差异不明显(图4)。

2.3 大颚器HMGR基因在蜕皮周期的表达水平分析

组织表达结果显示, HMGR基因在三疣梭子蟹MO中表达量最高, 所以选择MO为实验材料进行HMGR基因在蜕皮周期中的表达水平变化分析。qRT-PCR的结果表明三疣梭子蟹MO中的HMGR基因在整个蜕皮周期中均有表达, 从蜕皮A期至D0亚期逐渐上升至最高, 然后下降至D4亚期最低(图5)。

3 讨论

目前对于HMGR基因的研究多见于植物、哺乳动物、昆虫等, 在甲壳动物方面报道仅见于美洲海鳌虾。HMGR是甲羟戊酸合成途径中的限速酶, HMGR的活性是控制异戊二烯生成的重要因子。就目前为止发现的HMGR可分为两种类型: Ⅰ型主要存在于真核细胞; Ⅱ型主要存在于原核细胞, 二者的共同点是都在C-端具有催化功能的结构域(Bocharet al,1999)。本研究通过分子克隆技术得到三疣梭子蟹HMGR基因全长cDNA序列, 其开放阅读框所推导的氨基酸序列与已公布的美洲海螯虾HMGR序列(Liet al, 2004)的一致性为65%。对其功能结构位点进行分析, 发现该蛋白具有典型的Ⅰ型HMGR保守结构域, 含两个HMG-CoA 结合基序: ENVVGYMPVP和TTEGCLVA, 分别位于143(E)—152(P)和172(T)—179(A); 存在两个NADP(H)结合基序: DAMGMNM和GTVGGGT, 分别位于266(D)—272(M)和416(G)—422(T)。这两种基序是HMGR基因家族的保守序列和重要功能域(李嵘等, 2006; 谷巍等, 2011; 姜鸣等,2012), 是其活性所必需的典型多肽位点。HMGR利用NADP(H)的还原性H将底物HMG-CoA还原为甲羟戊酸, 高浓度的NADPH会抑制HMGR酶活性(Liet al, 2003)。其中, 研究已证明HMG-CoA结合基序TTEGCLVA 中的谷氨酸(Glu)在HMGR 催化中起着重要作用(Rupasingheet al, 2001)。说明本次克隆得到的序列属于Ⅰ型HMGR基因家族。

图2 三疣梭子蟹与美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列多重比对结果Fig.2 Multiple alignment of the HMGR amino acid sequence between P. trituberculatus and H. Americanus

图3 三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HMGRs from P. trituberculatus and other species

据研究美洲海鳌虾MO中存在两种构型的HMGR, 75%的HMGR属于可溶型的活性蛋白, 大小为66kDa(HMGR1); 另一种属于膜连结型, 大小为72kDa(HMGR2), 两者差别在于HMGR2的N端存在一个跨膜区域(Liet al, 2004)。在本次研究中, 只在三疣梭子蟹的MO中得到了一条HMGR序列, 经软件分析并不存在跨膜区域, 很可能是可溶型HMGR, 即与美洲海鳌虾HMGR1相似性更高。但是在其余物种(植物、昆虫、脊椎动物等)的HMGR基因克隆中, 绝大多数不存在亚型的情况, 而在甲壳动物方面可供参考的研究资料很缺乏, 尚待进一步研究。

从进化树分析图中发现甲壳动物的HMGR聚为一支, 与昆虫相比, 三疣梭子蟹HMGR与脊椎动物亲缘关系高一些。据研究美洲海鳌虾两条HMGR亚型(HMGR1和HMGR2)与哺乳动物的HMGR氨基酸序列更为相似(Liet al, 2004), 其次相似的是昆虫。与本次的进化树分析结果一致。可能是甲壳动物的HMGR基因在进化上高于昆虫, 逐渐趋近于脊椎动物。

图4 HMGR基因在不同组织的相对表达水平Fig.4 Relative expression of HMGR in various tissues in P.Trituberculatus

图5 MO中HMGR基因在三疣梭子蟹蜕皮周期中的相对表达差异Fig.5 Relative expression of HMGR in MO during molting stages in P. Trituberculatus

甲基法尼酯MF因参与到多种生理生殖的调控中, 逐渐成为甲壳动物的神经内分泌学的研究热点。在合成MF的过程中, HMGR催化生成甲羟戊酸的反应不可逆, 是催化MF合成初始步骤的关键限速酶,对甲壳动物的许多生理过程具有重要调控作用。在本研究中, 发现HMGR基因在三疣梭子蟹MO中表达量极高, 在其它组织表达量水平极低, 说明HMGR的主要生理功能就是在MO中催化甲羟戊酸途径合成萜类物质(包括MF)的生成, 再次证明MO是合成和分泌MF的唯一器官。在与甲壳动物关系最近的昆虫体内, HMGR基因在咽侧体中表达量较高; Li等人检测HMGR酶活性在美洲海鳌虾MO中最高, 在其余组织酶活性极低(Liet al, 2003), 与本研究结果基本一致。在切除美洲海鳌虾眼柄后, HMGR的活性上升, 血淋巴中MF的浓度与HMGR活性变化呈正相关;但在注射MOIH后, HMGR酶活性并未受到显著影响,说明HMGR很有可能还受到甲壳动物眼柄中其余途径的调控(Liet al, 2010)。

甲壳动物的蜕皮受神经系统和内分泌系统共同调控, 不仅有蜕皮酮和窦腺肽类激素的参与, MF也起到了重要作用(Wilderet al, 1995; Nagarajuet al,2006; 汪春建等, 2013;)。一般认为MF的合成路径分为两个阶段: 第一阶段生成法尼焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate, FPP); 第二阶段合成MF。HMGR是FPP合成的重要调控因子, 作为MF合成初始步骤的关键酶; 而法尼酸甲基转移酶(Farnesoic acid O-methyl transferase, FAMeT)是MF合成阶段最后一步催化法尼酸(Farnesoic acid, FA)转化为MF的重要限速酶, 被证明参与了三疣梭子蟹和拟穴青蟹等的蜕皮调控(谢熙等, 2013; Yanget al, 2012)。罗氏沼虾(M. rosenbergii)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)蜕皮周期血淋巴中MF浓度的检测结果显示, 在蜕皮后期和间期, MF水平较低, 在蜕皮前期, MF水平逐渐上升, 在临近蜕皮时下降(Wilderet al, 1995; Luferet al, 2005)。谢熙等的研究显示FAMeT基因在三疣梭子蟹蜕皮各阶段均有表达, 在D1亚期有显著性增加,随后逐渐下降(谢熙等, 2013)。本次实验中, HMGR基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的A期至C期相对表达量逐渐上升, 在D0亚期达到最高, 随后逐渐下降, 至D4亚期达到最低。该结果与三疣梭子蟹蜕皮周期中FAMeT基因的相对表达量和罗氏沼虾等血淋巴中MF水平变化相似, 且HMGR基因相对表达量更早达到高峰, 这可能与HMGR是MF合成路线上的初始关键酶有关。由此推测, 在三疣梭子蟹蜕皮后期至蜕皮前期初期, 其体内HMGR基因表达量开始逐渐升高并在蜕皮前期D0亚期高效表达, 促进FPP合成, 使蜕皮前期的血淋巴内MF浓度上升从而促进蜕皮的发生, 参与到蜕皮调控过程的发生。

本研究成功获得三疣梭子蟹HMGR基因全长cDNA序列, 通过分析HMGR基因在各组织的表达水平变化, 验证了MO是合成甲基法尼酯的唯一器官; 通过分析HMGR基因在蜕皮周期各期中的表达变化,可以认为HMGR基因在蜕皮前期初期高效表达促进蜕皮的发生。本文为进一步阐明甲壳动物蜕皮的调控机制和解决养殖过程中遇到的蜕皮过频和蜕皮未遂等问题奠定了一定基础。

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