奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

王妍慧 （山东省莱阳市畜牧兽医站 265200） 孙 礼 （山东省莱阳市畜牧兽医局）

乳房炎是奶牛的常发病、多发病，是造成奶牛业生产经济损失的重要因素之一。目前我国奶牛乳房炎发病率高达70%～80%[1]。导致奶牛乳房炎的因素很多，但病原微生物是导致乳房炎的主要病因。目前已报道的奶牛乳房炎病原菌主要以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占90%以上[2]。但由于这些病原菌与环境和管理关系密切，因此各个地区与不同奶牛群的感染情况各不相同，优势菌因养殖区域、饲养管理条件、奶牛个体差异的不同而不同[3,4]。无论是何种病原微生物引起的乳房炎，都应首先查明病因，再进行治疗，不可盲目地乱用抗生素，否则造成病情的加重和不必要的奶源污染[5]。我国不少学者对不同地区奶牛场的乳房炎进行了细菌分离与药敏试验，对该病的防治起到积极作用[9]。本研究对实际生产中一奶牛乳房炎病例进行病原菌的分离鉴定与药物敏感性试验，旨在为临床奶牛乳房炎的治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检乳样 样品采自山东省莱阳市某奶牛场3头临床乳房炎病牛的新鲜奶样。奶牛按常规挤奶消毒程序，先用温水冲洗乳房，然后用0.1%新洁尔灭清毒，最后用75%酒精消毒乳头。每个乳头弃去前3～4把奶，然后以无菌操作，每个乳室取奶样约10ml于灭菌小瓶中，加盖封紧，标号，置于附有冰袋的采样箱内，立即送检。

1.1.2 培养基及试剂 （1）培养基主要有普通琼脂培养基、鲜血琼脂、普通营养肉汤、甘露醇高盐琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、却甫曼琼脂培养基、改良德华琼脂培养基等。（2）生化试剂主要有糖生化发酵管、mR试剂、V-P试剂、吲哚试剂、尿素酶、枸橼酸盐、马尿酸盐、七叶苷等。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 取各乳房炎奶牛的乳样10ml，加入灭菌离心管中做好标记，以2000r/min离心15min，弃去管中上层液体，留取底部沉淀物。将沉淀物分别划线接种于普通营养琼脂、鲜血琼脂、麦康凯琼脂及伊红美蓝琼脂平板，置温箱37℃培养24h后，观察菌落形态特征，并选取形态不同的菌落涂片、革兰染色、镜检，根据菌体形态及染色特性初步判定细菌种类，并将其分别进行纯化培养。

1.2.2 生化试验 将分离纯培养的细菌分别做生化鉴定试验，根据《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)判定细菌种类。例如：对疑似葡萄球菌做生化鉴定，包括触酶试验、凝固酶试验及甘露醇发酵试验等；对疑似链球菌做生化鉴定，包括触酶试验、CAmP试验、马尿酸钠水解试 验、甘露醇和七叶苷发酵试验等。

1.2.3 药物敏感试验 选取青霉素、氨苄西林、先锋霉素V、头孢喹诺、头孢氨苄、强力霉素、氟苯尼考、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星12种抗生素采用纸片扩散法进行药物敏感试验。用吸管滴加纯培养菌液1滴(约0.02ml)于固体培养基平板上，用涂布器将菌液均匀涂布，加盖后放置10 min左右，待平板面稍干，用镊子将药敏纸片平放在琼脂平板上。贴好纸片的平板，置37℃培养24h，观察结果，测量抑菌圈直径。直径小于10mm为耐药，10～15mm之间为中度敏感，大于15mm为高度敏感[6-8]。

2 结果与分析

2.1 病原菌

奶样划线37℃培养24h后，在血琼脂平板上形成两种菌落。一种菌落周围呈现完全透明的溶血环，革兰染色阳性球菌，无芽孢、无荚膜、排列呈不规则的葡萄状，单个、成双或成链状排列，初步判定为金黄色葡萄球菌(编号A菌)；另一种菌落在血琼脂平板上呈圆形，表面光滑湿润，透明或半透明。周围呈现完全透明的溶血环，革兰染色阳性球菌，呈球形或卵圆形，多为链状排列，初步判定为链球菌(编号B菌)。A菌在却甫曼琼脂培养基上生长良好，产生湿润、光滑、隆起的黄色圆形菌落，直径2mm左右；B菌在改良德华琼脂培养基上生长良好，产生的菌落较小，呈针尖大小，灰白色，表面光滑。

2.2 生化试验结果

将分离到的2个株细菌纯培养后进行生化试验鉴定，结果如表1。

表1 分离菌生化试验结果

根据培养特点、菌落形态、革兰氏染色等特性及生化试验结果，判定所分离的细菌中A为葡萄球菌菌，B为无乳链球菌。

2.3 药敏试验结果

对分离的两种病原菌进行药敏试验结果(表2)表明，金黄色葡萄球菌对头孢喹诺、头孢氨苄、左诺氟沙星、氨苄西林、强力霉素高度敏感；无乳链球菌对头孢喹诺、头孢氨苄、左氧氟沙星高度敏感。也可以看出，引起本例乳房炎的主要病原菌对青霉素、先锋霉素V、氨苄西林等抗生素有了很强的耐药性。

表2 分离菌药敏试验结果(抑菌圈直径) (mm)

2.4 临床治疗

根据药敏试验结果，选用头孢喹诺、头孢氨苄、左氧氟沙星对每个感染乳区进行乳房灌注，轮换用药，剂量参照药品说明书。经敏感药物治疗5d后，3头奶牛乳房炎症状明显减轻，10d后痊愈。

3 讨论

3.1 致病菌种类

从病原菌的分离鉴定结果来看，引起本例牛乳房炎的主要是金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。金黄色葡萄球菌和链球菌属于传染性的病原体，且由相关资料表明，由该两类细菌感染引发的乳房炎达90%以上，在平时的饲养以及挤奶过程中的牛体的卫生消毒等环节的卫生不彻底，可能会导致奶牛感染病原菌而致病[6]。因此日常的饲养管理中，搞好环境卫生、注意清洁消毒对于预防和减少奶牛乳房炎的发生有重要的意义[7]。

3.2 抗菌药物的选择

抗生素作为治疗药物在奶牛乳房炎的控制中起了重要作用，但长期应用抗生素导致耐药性细菌大量滋生，使得常用的抗菌药物很难再发挥巨大的杀菌作用。从试验结果可知，引起本例牛乳房炎的两种主要病原菌对对青霉素、先锋霉素V、氨苄西林等抗生素均存在不同程度的耐药现象，尤其是青霉素类药物，产生了很强的耐药性，这与奶牛场长期将青霉素类药物用于干乳期封闭乳头有关。若在临床上继续使用青霉素类药物来治疗该病，将不能得到有效的控制，故应转而选用药物敏感性较高的药物，如头孢喹诺、头孢氨苄、左氧氟沙星等。

4 结论

奶牛乳房炎的发生，是病原、机体防卫功能、外界环境因素共同作用的结果，所以加强饲养管理，增强奶牛体质，注意环境卫生和挤奶卫生是预防乳房炎的重要措施。抗生素的广泛应用，菌株耐药增强，这不仅给乳房炎的有效防治带来障碍，而且还会给人类健康带来不利。因此，乳房炎治疗用药应在病原菌药敏试验结果的基础上确定，避免滥用抗生素。

[1]金尔光, 曾新华, 周木清等.奶牛乳房炎研究概况[J].养殖与饲料, 2008,(6): 69.

[2]周利青.奶牛乳房炎的研究进展[J].畜牧兽医科技信息, 2005(5): 8-9.

[3]K.Persson Waller、Host Resistantto, mastitis [J].Ruminant ysiology, 2000, 44(26): 449.

[4]倪语星, 洪秀华.细菌耐药性监测与抗感染治疗[m].北京: 人民军医出版社, 2002.

[5]东秀珠, 蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[m].北京: 科学出版社, 2001.

[6]Patrick B,Peter K,Daniela H,et al.methods for identification of staphylococcus aureusisolates in cases of bovine mastitis [J].Clin microbiol,2003,767-771.

[7]路建彪, 刘文强.奶牛乳房炎病原菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志, 2007, 43(1): 62.