重组人p53腺病毒在乳腺癌裸鼠体内耐药逆转作用及其对P-糖蛋白表达的影响

纪 楠，董 懿，唐 欣，刘爱惠，王钢乐

重组人p53腺病毒在乳腺癌裸鼠体内耐药逆转作用及其对P-糖蛋白表达的影响

纪 楠，董 懿，唐 欣，刘爱惠，王钢乐

目的研究重组人p53腺病毒(rAd-p53)对人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐药逆转作用及其对耐药相关P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表达的影响。方法建立人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐药模型，随机分为对照组、rAd-p53组、阿霉素组、联合组，分别给予不同治疗。观察裸鼠肿瘤体积的变化， western blot检测P-gp蛋白表达情况。结果成瘤后rAd-p53组、阿霉素组、联合组抑瘤率分别为42.05%、49.21%、69.97%，各治疗组体积与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组显著优于rAd-p53组和阿霉素组(P<0.05)。对照组、rAd-p53组、阿霉素组、联合组P-gp表达水平分别为(0.5964±0.0806)、(0.5506±0.0127)、(0.5641±0.0055)、(0.4652±0.0982)，联合组P-gp表达水平低于其他各组。结论Ad-p53对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR建立的裸鼠移植瘤具有多药耐药的逆转作用,并可下调P-gp的表达。

乳腺癌；p53基因；多药耐药；P-糖蛋白

肿瘤细胞的多药耐药(multi-drug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对多种结构类型和作用机制不同的药物同时产生抗药性，从而降低化疗药物的疗效。多药耐药性可成为影响化疗疗效的主要屏障。肿瘤产生MDR的原因十分复杂，其中多药耐药基因1(multidrug resistance 1, MDR1)编码的跨膜蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)高表达为其主要机制之一[1]。p53基因突变或缺失是目前发现的人类肿瘤细胞中最常见的基因突变之一，人类肿瘤中约50%存在p53基因突变[2]，其突变或缺失在多种肿瘤的发生发展及肿瘤化疗耐药的形成中起着重要作用，导致化疗失败[3,4]。有研究表明，突变型p53基因可增强MDR1/P-gp的启动子表达[5]，因此认为在肿瘤发生发展过程中MDR1/P-gp表达可能是p53抑癌基因突变失活的结果。本研究中，笔者以腺病毒介导的野生型p53基因导入到含突变型p53基因的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐药模型中，观察对其耐药性、P-gp表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞株及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr购自中国医学科学院肿瘤研究所；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周龄，17～20 g，购自首都医科大学实验动物部，SPF环境饲养；重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53)购自深圳赛百诺公司；阿霉素购自意大利法玛西亚普强公司； RPMI-1640、小牛血清均购自Gibco公司；β-actin由上海生工合成；鼠抗P-gp(C219)单克隆抗体购自Alexis公司；荧光标记山羊抗小鼠IgG购自rockland公司；β-Actin(C4)为Santa Cruz公司产品。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒滴度测定 rAd-p53剂量为1×1012VP/支(VP:病毒颗粒,virus particle),空斑实验确定其滴度为1×1010PFU /支(PFU:空斑形成单位,plaque forming unit)。

1.2.2 细胞培养 将人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR置于10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养，细胞为单层贴壁生长。用0.25%胰蛋白酶消化传代，每3～4 d传代1次。

1.2.3 人乳腺癌耐药裸鼠模型的建立及分组给药 取对数生长期MCF-7/ADR细胞进行实验。收集细胞并用PBS液配置成为5×107/ml细胞悬液。于5只BALB/C雌性裸鼠的右侧第2乳垫部位注射，0.1 ml/只，接种20 d后接种部位出现结节，待接种肿瘤直径长至5 mm，颈椎脱臼处死裸鼠，完整剥除肿瘤块，用其作为瘤源，将瘤块切成直径约2 mm，应用套管针埋入20只实验裸鼠右侧第2乳垫部位。乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR裸鼠移植瘤耐药模型建立。自肿瘤成功插块于裸鼠后第2天起，每日观察并隔2 d测量肿瘤体积，待第14天插块肿瘤直径长至5 mm后，随机将20只裸鼠分为4组，每组5只，分别为对照组、rAd-p53组、阿霉素组、联合给药组。自分组之日起，治疗方法为：(1)对照组，瘤内注射生理盐水0.1 ml/只，隔日给药，共7次；(2)rAd-p53组，第3天起，瘤内注射rAd-p53，每次5×1010Vp/只，隔日1次，共6次；(3) 阿霉素组，阿霉素4 mg/(kg·次)尾静脉注射，每4 d 1次，共4次；(4) 联合组，两药给药方法同前。

1.2.4 肿瘤体积测量及形态学观察 自分组之日起，用游标卡尺隔2 d测量肿瘤长短经，根据公式V=ab2/2(a为长径，b为短径)计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线、计算抑瘤率。同时自给药之日起观察裸鼠精神、饮食、活动、粪便等。用药后第44天，颈部脱臼法处死全部负瘤裸鼠，解剖裸鼠，观察局部浸润情况及有无其他脏器转移。

1.2.5 P-gp表达的检测 采用western blot半定量法。取肿瘤组织，用剪刀剪成细小颗粒，将样品加入含1 mmol/L DMSF的RIPA裂解液，并在冰域条件下于预冷的研钵中研磨均一，冰域条件下超声1 min，13 000 r/min,4 ℃离心15 min,取上清提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度。以30 μg/孔 上样，在8% SDS分离胶中恒压120 V进行电泳90 min，后100 V湿转至PVDF膜70 min，常温摇床下封闭1 h，鼠抗P-gp单克隆抗体(1∶1000)4 ℃孵育过夜，常温摇床TBST洗膜3次，荧光标记山羊抗小鼠IgG(1∶3000)常温摇床孵育1 h，常温摇床TBST洗膜3次，以β-actin(1∶1000)作为内参照，Odyssey荧光扫描。

2 结 果

2.1 裸鼠肿瘤体积变化及形态学情况 实验裸鼠被种植14 d后成瘤率为100%。用药后观察至第44天，肿瘤生长曲线见图1。对照组，rAd-p53组，阿霉素组，联合组肿瘤终末体积分别为(472.5±69.6)mm3，(273.8±50.4)mm3，(240±73.8)mm3，(141.9±44.8)mm3，各治疗组抑瘤率分别为42.05%，49.21%，69.97%，与对照组相比，体积差异均具有统计学意义(P<0.05)，且联合组显著优于rAd-p53组和阿霉素组(P<0.05)。解剖全部裸鼠，肉眼可见：肿瘤呈结节状生长，包膜完整，未向周围浸润，肿瘤切面灰白色，有部分出血坏死灶。双肺无肿瘤结节转移灶。

2.2 P-gp蛋白表达 Western blot检测显示见图2，对照组、rAd-p53组、阿霉素组、联合组的P-gp相对表达水平分别为0.5964±0.0806、0.5506±0.0127、0.5641±0.0055、0.4652±0.0982。与对照组相比，联合组对P-gp蛋白表达的影响差别有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

目前，在乳腺癌综合治疗中，化疗仍是重要手段。然而，许多乳腺癌患者经历了最初的一段有效化疗之后，出现肿瘤复发、转移，这主要归因于肿瘤MDR的产生，后者又与多种机制有关,其中MDR1/P-gp的高表达最为重要。文献[6]报道指出，未治乳腺癌中P-gp表达率约为40%，说明部分乳腺癌患者在接受化疗前就已存在MDR，而经化疗后P-gp蛋白的表达率可提高37%。此时化疗可诱发P-gp表达率增高[7-14]。

野生型p53基因所编码的p53蛋白在参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡、调节化疗敏感性等方面发挥着关键性的作用。近年来有研究表明，p53基因突变导致了其正常功能的丧失，参与了肿瘤化疗耐药的形成，导致化疗失败[7,8，15，16]。乳腺癌患者中20%～35%存在p53基因突变[9]，在不同的分子亚型中有着明显的差异，其中基底样乳腺癌患者中p53基因突变明显高于其他亚型[13]，这严重制约了乳腺癌治疗中化疗药物效能的发挥及患者的预后[14]。基于对p53基因的认识，笔者通过构建表达突变型p53的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐药模型，以其为研究对象，应用重组腺病毒介导的野生型p53基因对其进行转染，并联合阿霉素进行治疗，发现肿瘤生长明显受到抑制，且联合组较Ad-p53及阿霉素单独用药组对肿瘤的生长抑制作用更为显著。

P-gp是由多药耐药基因1(MDR1)基因编码的一种170 ku的跨膜蛋白，它是一种ATP依赖性转运排出泵，通过ATP提供能量将已进入细胞内的药物从胞内泵出胞外，使肿瘤细胞内药物浓度降低，从而减弱药物的细胞毒作用，产生耐药性[11]。有研究表明，突变型p53与Ets-1协同作用于MDR1启动子的Ets结合位点，从而促进内源性MDR1的转录及P-gp的表达[12,13]。本研究在向MCF-7/ADR移植瘤转染了Ad-p53后，对移植瘤组织中的MDR1基因所表达的P-gp蛋白进行检测，发现导入野生型p53基因后P-gp表达有所下降，而野生型p53联合阿霉素可使P-gp表达下降更为而显著，可见Ad-p53通过影响MCF-7/ADR裸鼠移植瘤中的P-gp蛋白表达可以在裸鼠体内逆转MCF-7/ADR移植瘤的MDR。

总之,p53基因和P-gp与肿瘤耐药性有密切联系,本研究结果表明Ad-p53可以通过下调P-gp的表达,逆转MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐药性,为临床上解决乳腺癌化疗耐药问题提供了体内实验依据，对乳腺癌的治疗具有一定的指导意义。

[1] 沈镇宙. 乳腺肿瘤学[M].上海: 科技出版社, 2005: 228-234.

[2] Petitjean A, Mathe E, Kato S,etal. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database [J]. Hum Mutat, 2007, 28: 622-629.

[3] Geisler S,Lønning P E,Aas T,etal. Influence of TP53 gene alterations and c-erbB-2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer[J].Cancer Res,2001,61:2505-2512.

[4] Lowe S W, Bodis S, McClatchey A,etal. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo[J]. Science,1994, 266: 807-810.

[5] Linn S C,Honkoop A H,Hoekman K,etal. p53 and P-glycoprotein are often co-expressed and are associated with poor prognosis in breast cancer [J]. Br J Cancer, 1996, 74(1): 63-68.

[6] Leonessa F，Clarke R. ATP binding cassette transporters and drug resistance in breast cancer [J]. Endocr Relat Cancer, 2003, 10(1): 43-73.

[7] Kudo I, Esumi M, Kida A,etal. p53 mutation, but not in vitro predictor genes of therapeutic efficacy of cisplatin, is clinically relevant in comparing partial and complete responder cases of maxillary squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep, 2010, 24(4): 851-856.

[8] Berge E O, Huun J, Lillehaug J R,etal. Functional characterisation of p53 mutants identified in breast cancers with suboptimal responses to anthracyclines or mitomycin [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(3): 2790-2797.

[9] Turpin E, Bieche I, Bertheau P,etal. Increased incidence of ERBB2 overexpression and TP53 mutation in inflammatory breast cancer [J]. Oncogene, 2002, 21(49): 7593-7597.

[10] Tan B, Piwnica-Worms D, Ratner L. Multidrug resistance transporters and modulation[J]. Curr Opin Oncol, 2000, 12(5): 450-458.

[11] Do P M, Varanasi L, Fan S,etal. Mutant p53 cooperates with ETS2 to promote etoposide resistance [J]. Genes Dev, 2012, 26(8): 830-845.

[12] Sampath J, Sun D, Kidd V J,etal. Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1[J]. J Biol Chem, 2001, 276(42): 39359-39367.

[13] Bertheau P, Lehmann-Che J, Varna M,etal. P53 in breast cancer subtypes and new insights into response to chemotherapy [J]. Breast, 2013, 22(2): S27-29.

[14] He S Z, Qi X D, Zhang X M, Wang Y.Experimental study of adenovirus-mudiated p53 gene on the reversal of multidrug resistance in breast cancer[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2007,87(41):2935-2937.

[15] Dalmases A, Gonzalez l, Menendez S,etal. Deficiency in p53 is required for doxorubicin induced transcriptional activation of NF-кB target genes in human breast cancer[J].Oncotarget,2014,5(1):196-210.

[16] Kandioler-Eckersberger D, Ludwig C, Rudas M,etal. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2000,6(1):50-56.

(2013-11-18收稿 2014-01-20修回)

(责任编辑 武建虎)

Effectofadenovirus-mediatedp53genetherapyonreversingmultidrugresistanceinbreastcancerinvivoanditseffectonexpressionofP-gp

JI Nan, DONG Yi, TANG Xin, LIU Aihui, and WANG Gangyue. Department of Breast, Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital, Capital Medical University, Beijing 100026, China

ObjectiveTo study the effect of recombinant adenovirus mediated p53 gene on reversing multidrug resistance and expression of P-gp in MCF-7/ADR human breast cancer xenografts.MethodsMCF-7/ADR human breast cancer cells were injected into nude mice. The experimental mice with xenografts were randomized into groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin. The growth of tumor was observed. Expression of P-gp in several groups was assessed by Western blotting.ResultsThe inhibitory rate after administration of rAd-p53, adriamycin, and rAd-p53+adriamycin were 42.05%，49.21%， and 69.97%, respectively. There was significant difference between all treatment groups and control group (P<0.05). And inhibition in group rAd-p53+adriamycin was more significant than inhibition in group rAd-p53 and group adriamycin. The expression of P-gp in groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin were (0.5964±0.0806), (0.5506±0.0127), (0.5641±0.0055), and (0.4652±0.0982), respectively it was decreased significantly in group rAd-p53+Adriamycin.ConclusionsrAd-p53 can effectively reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADR xenografts in nude mice. And it can inhibit the expression of P-gp.

breast cancer; P53 gene; multidrug resistance; P-glycoprotein

纪 楠，硕士，住院医师，E-mail:vessica828@sina.com

100026，首都医科大学附属北京妇产医院乳腺科

王钢乐，E-mail: gangyue_wang@163.com

R737.9