响应面法优化杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺研究

张琳杰，彭 胜，张昌伟，王志宏，周云雷，彭密军，*，张水寒

（1.吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，杜仲湖南省工程实验室，湖南张家界427000；2.湖南省中医药研究院，湖南省中药新药研究与开发重点实验室，湖南长沙410013）

响应面法优化杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺研究

张琳杰1，彭 胜1，张昌伟1，王志宏1，周云雷1，彭密军1，*，张水寒2

（1.吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，杜仲湖南省工程实验室，湖南张家界427000；2.湖南省中医药研究院，湖南省中药新药研究与开发重点实验室，湖南长沙410013）

采用响应面法优化杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺。考察了提取溶剂、液料比、提取时间、提取温度及提取次数对提取工艺的影响，在单因素实验分析的基础上采用Box-Benhnken中心组合进行4因素3水平的实验设计，以总多酚得率为响应值，进行响应面分析，建立二次多项回归数学模型，并优化提取工艺。结果表明杜仲叶中总多酚超声波辅助提取最佳工艺为：55%乙醇、液料比为25∶1mL·g-1、45℃下提取25min，提取两次，在此条件下，总多酚得率为4.678%。

杜仲叶，总多酚，超声波辅助提取，响应面法

杜仲为我国名贵的滋补中药之一，具有降血压[1-2]、补肝肾[3-4]、强筋骨[5-6]等诸多功效，杜仲叶是我国卫生部审批通过的药食两用类植物，其内含有多种活性成分，如黄酮类[7]、以绿原酸为主的苯丙素类物质[8]、木脂素类[9]、环烯醚萜类[10]等，其中黄酮和绿原酸从其结构上又可归为植物多酚类化合物。植物多酚具有较强的清除自由基、抗衰老、抗辐射、抗菌、杀菌等作用[11-14]，被称为“第七类营养素”，在食品、化妆品及医药行业等具有广阔的市场前景。杜仲叶中总多酚提取物可用作诸多行业生产的功效成分。目前已有以杜仲叶浸提液与桑叶、五味子、山楂等植物提取物等为原料配制各种具有不同功能保健食品的文献报道[15-17]，但是杜仲叶中总多酚提取的相关报道则较少。为保证杜仲叶浸提液中多酚类物质含量的最大化，本实验考察了杜仲叶中总多酚的提取工艺。

总多酚的提取方法主要有超声波辅助法、微波辅助法、酶法等，其中超声波辅助提取方法具有操作简便、提取率高、能耗低且不破坏被提取物结构等诸多优点，已被广泛应用于天然植物有效成分的提取。杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺受诸多因素的影响，且各因素之间还可能存在着交互作用，因此本实验应用响应面法对该工艺条件进行分析与优化，考察提取溶剂、液料比、提取温度、提取时间等因素影响总多酚提取的变化规律及各因素之间的交互作用，以期获得杜仲叶中总多酚超声波辅助提取的优化工艺条件，为杜仲叶的综合开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶 于2012年9月份采于吉首大学张家界校区杜仲实验基地，经吉首大学谷伏安副教授鉴定为杜仲科杜仲属植物，样品采集后微波杀青50℃烘干，粉碎过80目筛，装袋置于冰箱中4℃保存备用；甲醇、95%乙醇 AR，上海恒兴（集团）有限公司；没食子酸 Gallic acid（GA），≥98%，张家界奥威科技有限公司；福林酚试剂 Folin-Ciocalteu’s phenol Reagent（FC），BR，上海蓝季科技发展有限公司；无水碳酸钠 AR，成都市科龙试剂化工厂；实验所用水 均为蒸馏水。

UV-3900紫外-可见分光光度计 日本HITACHI；AEG-220万分之一天平 日本SHIMADZU；WD-700微波炉 乐金电子（天津）电器有限公司；GZX-9146数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SB-25-12DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲叶总多酚提取工艺 提取工艺流程如下：杜仲叶→干燥→粉碎→过80目筛→超声波辅助提取→过滤→测定吸光度→计算总多酚得率。

1.2.2 多酚标准曲线的建立 以没食子酸为对照品，FC（Folin-Ciocalteu，福林酚）比色法[18]测定系列标准溶液的吸光度A，以标准溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，并计算样品中总多酚含量。标准曲线方程为：A=0.0135C+0.0196，R2= 0.9991。

1.2.3 多酚的计算公式 以总多酚得率为指标考察单因素及响应面实验结果，总多酚得率计算公式如下：Y（%）=W1/W2×100，式中，Y为总多酚得率，W1为提取液中总多酚质量，W2为称取杜仲叶质量。

1.2.4 单因素实验设计

1.2.4.1 提取溶剂的单因素实验 由于多酚类化合物均含有多个羟基，极性较大，因此选择水、甲醇、乙醇为溶剂进行提取。准确称取0.5g样品，分别加入10.0mL体积分数为0%（蒸馏水）、10%、30%、50%、70%、90%甲醇、乙醇溶液，25℃下提取30min，提取两次，合并两次提取液并定容于50mL容量瓶，考察溶剂对总多酚得率的影响。

1.2.4.2 液料比的单因素实验 准确称取0.5g样品，按液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1mL·g-1加入相应体积的50%乙醇溶液，25℃下超声提取30min，提取两次，计算不同液料比下总多酚得率。

1.2.4.3 提取温度的单因素实验 准确称取0.5g样品，加入10.0mL 50%乙醇，分别在25、35、45、55和65℃下提取30min，提取两次，计算不同温度下总多酚得率。

1.2.4.4 提取时间的单因素实验 准确称取0.5g样品，加入10.0mL 50%乙醇，25℃下分别提取15、20、25、30、35min，提取两次，计算不同提取时间下总多酚得率。

1.2.4.5 提取次数的单因素实验 准确称取0.5g样品，加入10.0mL 50%的乙醇，25℃下超声提取30min，分别提取1、2、3、4、5次，滤液定容于50mL容量瓶，计算不同提取次数下总多酚得率。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验基础上，确定影响杜仲叶中总多酚得率较为显著的因素，即提取溶剂、液料比、提取温度及提取时间，以总多酚得率为响应值，采用Box-Behnken设计法优化杜仲叶中总多酚提取工艺条件，各因素水平及编码见表1。

表1 响应面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.3 数据分析处理

采用Design-Expert 8.0进行响应面实验设计及数据分析，其余数据利用EXCEL 2007进行统计分析。

2 结果与分析

图1 提取溶剂对总多酚得率的影响Fig.1 The influence of extraction solvents on the yield of total polyphenols

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取溶剂对总多酚得率的影响 提取溶剂对超声波提取的影响如图1所示，随着溶剂浓度的增加，使用甲醇体系与乙醇体系进行提取所得总多酚得率变化趋势基本一致，均为先增长后降低，其中50%乙醇提取所得总多酚得率最大。其主要原因是杜仲叶中总多酚与50%乙醇极性最为接近，在其中溶解度最大，故以体积分数为50%的乙醇作为提取溶剂为较优选择。

2.1.2 液料比对总多酚得率的影响 液料比对超声波提取的影响如图2所示，随着溶剂用量的增加，总多酚得率随之提高，当液料比超过20∶1mL·g-1时总多酚的得率反而下降，这可能是因为当液料比达到20∶1mL·g-1时杜仲叶中的总多酚在提取溶剂中的溶出已基本达到动态平衡，继续增大液料比不仅会增加其他杂质的溶出，还会增大后续回收溶剂的工作量。因此确定20∶1mL·g-1的液料比较适宜。

图2 液料比对杜仲叶中总多酚得率的影响Fig.2 The influence of liquid-to-solid ratio on the yield of total polyphenols

2.1.3 提取温度对总多酚得率的影响 提取温度对超声波提取的影响如图3所示，随着温度的升高，总多酚得率先升高而后急剧降低。这与总多酚的热稳定性有关，多酚类物质含有大量酚羟基，化学性质较为活泼，高温会导致其结构的不稳定甚至降解，从而影响总多酚得率。因此总多酚的提取温度控制在35℃左右较优。

图3 提取温度对杜仲叶中总多酚得率的影响Fig.3 The influence of extraction temperature on the yield of total polyphenols

2.1.4 提取时间对总多酚得率的影响 液料比对超声波提取的影响如图4示，总多酚得率首先随着提取时间的增加而增加，超过30min后，总多酚得率增长缓慢。这可能是因为总多酚的溶出需要一定的时间，适当延长时间其得率会增加，当总多酚得率达到最大值后，继续延长时间，将会增加杂质的溶出，同时增加提取成本，因此提取时间以30min较优。

图4 提取时间对杜仲叶中总多酚得率的影响Fig.4 The influence of extraction time on the yield of total polyphenols

2.1.5 提取次数对总多酚得率的选择 提取次数对超声波提取方法的影响如图5所示，由图5可知，随着提取次数的增加，总多酚的溶出率也随之增加，2次提取的效果（4.583%）明显高于1次（4.432%），继续增加提取次数，还会有少量的多酚溶出（4.600%），但对其得率贡献不大，之后总多酚得率变化趋于平缓（4.631%、4.642%），因此从总多酚得率及节约试剂的角度出发，选择提取次数为2次，后续所有实验固定提取次数为2次。

图5 提取次数对杜仲叶中总多酚得率的影响Fig.5 The influence of extraction times on the yield of total polyphenols

2.2 响应面法实验设计及结果

2.2.1 响应面法实验设计及结果 根据Box-Behnken的统计设计原理，参考单因素实验结果，固定提取次数为2次，选择提取溶剂、液料比、提取温度及提取时间四个因素，进行四因素三水平实验设计，共29个实验点，每个实验点三次平行，实验结果见表2。

2.2.2 响应面法回归方程及方差分析 由Box-Benhnken设计拟合，得到响应值Y对编码自变量的二次多项回归方程为：Y=4.30+0.29A+0.24B+0.16C+ 0.058D-0.15AB+0.066AC-0.13AD+0.039BC-3.9750E-003BD-0.18CD-0.75A2-0.078B2-0.013C2+1.767E-003D2。从该回归方程可以看出，四个因素对响应值的影响顺序为：溶剂浓度（A）＞液料比（B）＞提取温度（C）＞提取时间（D）。对该模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。

该回归方程的F值为31.25，概率p＜0.0001，表明模型显著；确定系数R2adj=0.9380，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系显著；变异系数c.v.=3.05%，说明该回归方程精密度良好；失拟项F值为5.76，概率p=0.0531＞0.05，失拟项不显著，表明该回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，可用该模型代替实验真实点对实验结果进行分析。由表3可知，对总多酚得率影响显著的因素是A、B、C、AB、AD、CD、A2、C2，说明响应值与因素之间不是简单的线性关系，二次项对响应值也有影响，且因素A与B、A与D、C与D对响应值有较强的交互作用。

2.2.3 响应曲面图分析 根据二次多项回归方程，建立各因素两两交互作用响应曲面图，如图6～图8所示。由图6可以看出，液料比一定时，随着提取溶剂浓度增大，总多酚得率逐渐增大，当响应值增加到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。溶剂浓度一定时，料液比对总多酚得率的影响较小。响应面投影呈椭圆形，说明提取溶剂浓度与液料比的交互作用对总多酚得率影响较大，这与方差分析结果一致。

表2 响应面实验方案及实验结果Table 2 The experiment design and results of RSM

图6 溶剂浓度与液料比对总多酚得率影响的响应面图Fig.6 Response surface for the effect of extraction solvent and liquid-to-solid ratio on the yield of total polyphenols

图7与图6变化趋势基本一致，提取时间一定时，总多酚得率随着提取溶剂浓度的增加而增加，达到极值后随着提取溶剂浓度的增加而逐渐减少。溶剂浓度一定时，随着提取时间的增加，总多酚得率基本保持不变，提取时间对总多酚得率的影响较小。响应面投影也呈椭圆形，说明提取溶剂浓度与提取时间的交互作用对总多酚得率影响较大，与方差分析结果吻合。

图7 溶剂浓度与提取时间对总多酚得率影响的响应面图Fig.7 Response surface for the effect of extraction solvent and time on the yield of total polyphenols

图8 提取温度与提取时间对总多酚得率影响的响应面图Fig.8 Response surface for the effect of extraction temperature and time on the yield of total polyphenols

图8中，在提取温度取值较小时，响应值随提取时间的增加而增加，提取温度取值较大时，响应值与提取时间变化趋势相反，而随着提取温度的增加，响应面为一不对称曲面且坡度较陡，说明提取温度与提取时间之间交互作用明显。当提取温度较低时，延长超声波辅助提取的时间可以提高杜仲叶中总多酚的得率，而当提取温度较高时，总多酚溶出速度加快，但是为了避免热敏性多酚类物质因温度过高而导致的结构破坏，必须适当缩短超声波辅助提取时间。

表3 响应面二次回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

2.2.4 优化与验证实验 对回归方程求一阶偏导并使其等于零，求解方程即可得到响应值最大时各因素取值，即杜仲叶中总多酚超声波辅助提取的最佳工艺条件为：提取溶剂为54.41%的乙醇溶液，液料比为25∶1mL·g-1，提取温度为45℃，提取25min，提取2次。考虑到实际实验的可操作性，将上述最优参数调整如下：提取溶剂55%乙醇，液料比25∶1mL·g-1，45℃下提取25min，提取2次，并据此进行结果验证，平行测定3次。杜仲叶中总多酚平均得率为4.678%± 0.0158%，与模型预测值（4.688%）的相对误差为0.22%＜5%，在可允许范围内，且远远高于文献报道中采用超声法最优工艺进行提取得到的杜仲叶中多酚得率（0.175%）[19]，说明经模型推测得到的最佳工艺参数对实际实验的预测较为可靠，具有一定的指导意义。

3 结论

通过单因素实验探索提取溶剂、液料比、提取温度、提取时间及提取次数对杜仲叶中总多酚超声波辅助提取的影响，选取Box-Benhnken实验的范围和水平，应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究，建立了影响总多酚得率的二次多项回归方程模型，得到杜仲叶中总多酚超声波辅助提取最佳工艺条件为：55%乙醇，25∶1mL·g-1料液比，45℃下提取25min，提取两次。在此条件下，杜仲叶中总多酚得率为4.678%，与模型预测值（4.688%）相差0.22%，工艺条件准确可靠，且该工艺生产周期短、能耗低，易于操作，可为后期杜仲叶综合开发利用提供依据。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction technology for total polyphenols in leaves of Eucommia ulmoides Olive using response surface methodology

ZHANG Lin-jie1，PENG Sheng1，ZHANG Chang-wei1，WANG Zhi-hong1，ZHOU Yun-lei1，PENG Mi-jun1，*，ZHANG Shui-han2
（1.Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering，Hunan Engineering Laboratory for Eucommia ulmoides Oliv.，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China；2.Key Laboratory of Research and Development of New Drug of Chinese Traditional Medicine，Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410013，China）

Response surface analysis methodology（RSM）was used to optimizing the ultrasonic assisted extraction technology of total polyphenols in leaves of Eucommia ulmoides Olive.The influence on the technology caused by the variety of extraction solvents and the concentrations，liquid-to-solid ratio，extraction time，extraction temperature and extraction times was investigated.Experiments were arranged according to Box-Behnken central composite experiment design based on results of single-factor experiments.Response surface analysis was applied to create the two multinomial mathematical and optimize the extract process. Results showed that the optimum parameters for extracting from leaves of Eucommia ulmoides Olive were 55% ethanol，25 times the amount of solvent and 25min at 45℃ twice.Under these condition，the yield of total polyphenols was 4.678%.

leaves of Eucommia ulmoides Olive；total polyphenols；ultrasonic assisted extraction；response surface method

Q351

B

1002-0306（2014）08-0228-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.043

2013－07－31 *通讯联系人

张琳杰（1989-），女，硕士研究生，研究方向：林产资源化学。

国家“十二五”科技支撑计划（2011BAI01B08）；湖南省科技厅项目（2012FJ4294）；湖南省高校科技创新团队支持计划资助项目（湘教通（2010）212号；湖南省教育厅项目（11CY015）；吉首大学研究生科研创新基金项目（JGY201226）。