一株产乙酸乙酯酵母C42的分离与鉴定

李志辉，任蓓蕾，朱健辉，杜萍萍，张莹莹，何俊萍，张 伟，王 颉，檀建新，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北省农产品加工工程技术中心，河北保定071001；2.中国科学院北京基因组研究所，中国科学院基因科学与信息重点实验室，北京100101）

一株产乙酸乙酯酵母C42的分离与鉴定

李志辉1，任蓓蕾1，朱健辉2，杜萍萍1，张莹莹1，何俊萍1，张 伟1，王 颉1，檀建新1，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北省农产品加工工程技术中心，河北保定071001；2.中国科学院北京基因组研究所，中国科学院基因科学与信息重点实验室，北京100101）

从采自沧州良种枣繁育基地的200份枣果实样品中利用含有10%乙醇的YPD平板分离、筛选得到了36株耐酒精酵母菌株，其中一株酵母能产生愉悦的水果香味，命名为C-42。通过形态学，生理生化实验和18S rDNA序列同源性比对，证明该株酵母菌是异威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anomalus）。气相色谱分析表明酵母菌株C-42在麦芽汁培养基中发酵一周后可产生乙酸乙酯，浓度可达154mg/L，说明该菌株在发酵工业中具有应用潜力。

产香酵母，气相色谱，乙酸乙酯

酵母菌是单细胞真核微生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中等[1]。生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属，是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种[2]。虽然生香酵母发酵产生乙醇的能力弱于酿酒酵母，但能够合成多种酶，将原料中的前体物质转换成风味物质如酯、酸、高级醇和醛等产物，对调味品和酒的风味、质地和色泽的形成起到重要的作用。此外，还能抑制发酵过程中一些腐败微生物的繁殖[3-5]。在白酒发酵过程中，由于其产乙醇能力低，不适合作为酒精发酵的主要菌种，而是将其与酿酒酵母一起混合使用[6]，与单独使用酿酒酵母相比，得到的酒类风味更为丰富，香味更加突出[7-8]，更受消费者欢迎，因而生香酵母是白酒等生产和发酵调味品生产中重要的微生物菌种资源，新的生香酵母菌株分离和应用对开发和生产具有特色风味的酒类和发酵调味品具有重要意义。

乙酸乙酯是酒类等发酵产品的主要香味物质之一，是产香酵母发酵产生脂类主要成分[9-10]。本实验从枣果实中分离出来一株产香能力突出的酵母菌种，通过形态学，生理生化实验和18S rDNA序列对比分析，确定为Wickerhamomyces属的Wickerhamomyces anomalus。通过气相色谱（GC）测定其产乙醇和乙酸乙酯的量。为该菌株的后续实验研究和生产应用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枣果实样品 采自沧州枣良种繁育基地，枣成熟时候收获的无病虫害的果实；乙酸乙酯（色谱纯） 购自天津康科德科技有限公司；18S rDNA上游引物和下游引物[11]由大连宝生物有限公司合成；2×EsTaq Master Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶、T载体 购自大连宝生物；H2SO3（分析纯）和95%乙醇溶液 均购自天津市福晨化学制剂厂；麦芽汁 购自保定生力啤酒厂；实验所需的其他试剂 均购自大连宝生物公司。

GC-7960型气相色谱仪 美国Agilent公司；TGWAXMS毛细管色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm） 美国Thermo公司。

1.2 培养基

YPD培养基用于酵母分离纯化，玉米粉琼脂培养基观察假菌丝，产子囊孢子培养基，维生素生长培养基等用于酵母生理生化实验的培养基均参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[12]。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母的分离纯化 将取自沧州良种枣繁育基地的200份枣果实样品分别称取1g加入含有8%乙醇的5mL YPD液体培养基中，28℃静置培养3d。取200μL富集液，稀释100倍均匀涂布在含有10%乙醇的YPD固体平板培养基上，28℃培养2d。挑选出含有香味的平板，挑取其单菌落进行划线分纯，直至连续3代均有香气，显微镜下观察菌体形态一致。

1.3.2 酵母的鉴定

1.3.2.1 形态学观察和生理生化实验 将纯化的酵母菌株分别接种到产孢子培养基和玉米粉琼脂培养基上，25℃培养5～7d，观察产孢子和产假菌丝的情况；糖发酵实验：供试的糖包括：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和棉子糖；碳源同化：根据需要选用18种碳源作为同化实验对象，包括：半乳糖、棉籽糖、赤藓糖醇、蔗糖、可溶性淀粉、核糖醇、麦芽糖、D-木糖、D-甘露糖醇、纤维二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、柠檬酸、乳糖、L-鼠李糖和肌醇；氮源同化：氮源包括为硝酸钾、盐酸乙胺、盐酸尸胺和L-赖氨酸；放线菌素酮抗性实验；维生素生长测试；脲酶实验。以上实验的具体操作过程参见《酵母菌的特征与鉴定手册》[12]。

1.3.2.2 18S rDNA鉴定 酵母DNA提取的操作过程参见文献[13-14]。PCR扩增体系和条件：18S rDNA PCR扩增反应的上游引物是5’-GTAGTCATATGCTT GTCTC-3’，下游引物是5’-GGCTGCTGGCACCAGA CTTGC-3’。反应在20μL的体系中完成，其中包括2μL模板DNA，上下游引物各1μL，2×EsTaq MasterMix 10μL，蒸馏水6μL。PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环后72℃延伸10min。

胶回收、连接及测序：将PCR产物用2%的琼脂糖进行凝胶电泳分离，将目的条带切下，按照胶回收试剂盒里的说明书，进行目的片段回收。将回收后的PCR产物与pMD-18连接，转化到大肠杆菌JM109，挑选阳性转化子进行验证测序[14]，测序由北京华大基因公司完成。

DNA序列比对和系统树构建：将测序结果在NCBI的BLAST网页上比对，确定与生香酵母18S rDNA序列相似度最高的序列和微生物种，比对并生成系统发育树。

1.3.3 麦芽汁发酵 在300mL的三角瓶中加入120mL麦芽汁培养基（11°Brix），加入300μL H2SO3（终浓度60mg/L），接入5%已活化的生香酵母菌种，同时接种等量的市售的酿酒酵母作为对照。30℃条件下发酵，每天称重，直至重量变化小于0.5g时停止发酵。每组实验重复3次。

1.3.4 酒样制备 参照文献[15]蒸馏酒样的方法获得酒的蒸馏液。

1.3.5 发酵产生的乙酸乙酯的测定 采用TG-WAXMS毛细管色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm），色谱条件：进样口温度240℃。升温程序：初始温度40℃保持2min，随后以5℃/min升温至80℃，再以20℃/min升至220℃，保持10min；载气为氦气，流速1mL/min，分流比20∶1。

称取乙酸乙酯（分析纯）的标准品4.00g于10mL的容量瓶中，用60%的乙醇溶液溶解并定容到10mL，得到乙酸乙酯的标准储备液。分别吸取储备液用60%乙醇稀释，配成乙酸乙酯浓度分别为0.01、0.02、0.08、0.20、0.32mg/mL的混合标准溶液。然后分别以1μL进样，建立标准曲线。

取蒸馏的酒样以1μL进样。每个酒样重复3次。应用气相色谱的自带的软件计算峰面积。

用EXCEL软件建立乙酸乙酯含量与峰面积的标准曲线，计算待测样品中的乙酸乙酯含量。

2 结果与分析

2.1 生香酵母菌株C-42的分离纯化和形态特征

图1 生香酵母C-42的菌落和菌体形态（400×）Fig.1 The colonial and cell morphology of aroma-producing yeast strain C-42（400×）

从沧州枣良种繁育基地采集枣样品，利用高浓度乙醇抑制酵母以外的微生物生长的方法筛选得到了36株酵母菌，其中一株酵母菌能产生明显的水果香味，经过分离纯化后，香味保持不变，将该菌株命名为生香酵母C-42。YPD平板培养基上生香酵母C-42的单个菌落呈圆形，边缘整齐，中心突出，乳白色，表面湿润，粘稠，易挑起。在400倍显微镜下观察，C-42的单个菌体呈圆形，无鞭毛，无假丝，体积较大，具有典型的真核细胞的结构特点，且出芽生殖（图1）。在产孢培养基可看到部分细胞产子囊孢子，且每一子囊内含有1～4枚子囊孢子，子囊孢子呈光滑的圆形或礼帽形，在玉米粉琼脂培养基上没有观察到假菌丝。

2.2 生香酵母C-42的生理生化鉴定

参照《酵母菌的特征与鉴定手册》，通过糖的发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验、放线菌酮实验、无维生素培养基的生长情况、尿素水解实验，对生香酵母C-42进行了生理生化鉴定，结果见表1。根据表1中生香酵母C-42生理生化的实验的结果，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》，初步判定该菌株属于Wickerhamomyces anomalus。

表1 生香酵母C-42的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the aroma-producing yeast strain C-42

2.3 生香酵母C-42的18S rDNA分子生物学鉴定

因为酵母菌等真菌的18S rDNA相对较为保守，其碱基序列变化能在一定程度上反映出种属的变化，因此，18S rDNA序列常被用来做为酵母菌的分类鉴定上的依据。在生理生化鉴定的基础上，对生香酵母C-42的18S rDNA进行了PCR扩增，PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分析，得到一条清晰的约500bp的条带，其大小与预测扩增片段的长度一致，表明扩增出了正确的片段（图2）。

将该片段测序，其序列在NCBI（WWW.NCBI. COM）上进行Blast比对，结果表明生香酵母C-42测定的500bp大小的DNA片段与公布的Wickerhamomyces anomalus菌株的18S rDNA序列在相同区域的相似度均为100%，而与其他物种的亲缘关系较远，根据其18S rDNA比对结果使用Bioedit软件所建立的系统发育树见图3。根据上述结果初步判断该菌株为Wickerhamomyces anomalus，结合前面形态学和生理生化鉴定结果，确定该菌株为Wickerhamomyces anomalus。

图2 PCR产物的琼脂糖凝胶分析Fig.2 Agarose gel analysis of PCR products

图3 生香酵母C-42（lcl|24981）系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the aroma-producing yeast strain C-42（LCL24981）

2.4 生香酵母C-42产乙酸乙酯的检测

生香酵母C-42能产生浓郁的水果香味，与乙酸乙酯气味相近，初步判定其香味物质可能是乙酸乙酯。所以用气相色谱检测生香酵母C-42发酵麦芽汁之后产生的乙酸乙酯，图4是样品通过气相色谱的图谱，其发酵产物中含有多种成分，如乙酸乙酯、乙醇、正丙醇等，其中保留时间为11.32min的色谱峰与乙酸乙酯标准色谱峰的保留时间相同，表明该菌株具有乙酸乙酯的合成能力（见表2）。将生香酵母C-42和酿酒酵母分别在麦芽汁培养基中培养，产生的乙酸乙酯经蒸馏提取后进行气相色谱的检测，根据乙酸乙酯的标准曲线的公式：y=163.93x-0.3594（R2=0.9999）计算其含量，经测定可知，生香酵母C-42、酿酒酵母两种不同的酵母菌株发酵7d所得乙酸乙酯含量分别为（153.27±0.23）mg/L和（8.62±0.55）mg/L，生香酵母C-42的乙酸乙酯产量是酿酒酵母的17.78倍，说明生香酵母C-42具有较强的乙酸乙酯合成能力。

图4 酵母菌株C-42发酵后样品气相色谱图Fig.4 The gas chromatogram of fermentation sample of the aroma-producing yeast strain C-42

表2 生香酵母C-42主要发酵产物的气相色谱分析Table 2 The GC analysis of the main fermentation products of the aroma-producing yeast strain C-42

3 结论与讨论

近年来关于产香酵母发酵产生的高浓幅度发酵混合物研究越来越受到人们的关注，而这些物质是形成酒中香气的主要成分。产香酵母的种类很多，目前研究较多的有柠檬型克勒克酵母、毕赤酵母属、汉森酵母书、假丝酵母属等[11，16]。将产香酵母与酿酒酵母混合发酵，在保证一定酒精度的同时，产香酵母产生大量的香气物质，以增加酒的香气，改善酒的品质，增加酒体的层次感，深受酿酒行业的推崇。有研究表明，利用产香酵母和酿酒酵母混合发酵有效地控制了发酵行为，与纯种酿酒酵母发酵酒比，在乙酸乙酯、乙酸香叶酯、乙酸异戊酯和二苯乙酯等成分含量上均有不同，所酿葡萄酒的特色更加突出[16]。也有人将酿酒酵母和产香酵母进行混菌发酵，得到的产品乙醇浓度为201.7mg/L，乙酸乙酯含量达到740mg/L[6]，在提高风味物质的同时，降低了总酸和高级醇的含量，有效改善了发酵液的风味特性。

本实验通过高浓度乙醇抑制细菌和霉菌的生长，从采自沧州枣良种繁育基地的枣果实样品中分离纯化得到了一株产生水果香味的酵母菌株C-42。通过形态学，生理生化实验，18s rDNA序列比对分析的方法，鉴定该菌为异威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

通过气相色谱测定了酵母C-42在麦芽汁发酵培养基培养一周后发酵液带有浓郁的酯香，类似水果的香味，产生乙酸乙酯的浓度为（153.27±0.23）mg/L，虽然较740mg/L较低，但本实验中并未对C-42的生长及发酵条件进行优化，产酯能力已经很高，表明该菌是一株能产生良好香气的酵母菌株，有巨大的潜在价值进行更深入的研究，用于酿酒或酒精饮料类的生产，以增加酒的香气，提高酒体的品质。

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Isolation and identification of an ethyl acetate producing yeast strain C-42

LI Zhi-hui1，REN Bei-lei1，ZHU Jian-hui2，DU Ping-ping1，ZHANG Ying-ying1，HE Jun-ping1，ZHANG Wei1，WANG Jie1，TAN Jian-xin1，*
（1.College of Food Science，Agricultural University of Hebei，Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing，Baoding 071001，China；2.CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information，Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Thirty six yeast strains which were resistant to alcohol on YPD plate containing 10%ethanol were isolated from 200 jujube fruit samples collected from Cangzhou Jujube Seed Breeding Base.Among these strains，a yeast strain producing pleasant fruit flavors，named C-42，were isolated.It was identified as Wickerhamomyces anomalus by the morphological，physiological and biochemical tests and the homological comparison of 18S rDNA sequence.Gas chromatography analysis showed that the yeast strain C-42 could produce ethyl acetate up to 154mg/L after a week-long fermentation in wort medium.The strain may have potential applications in the fermentation industry.

ester-producing yeast；GC；ethyl acetate

TS261.1

A

1002-0306（2014）08-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.034

2013－07－16 *通讯联系人

李志辉（1986-），男，硕士研究生，研究方向：工业微生物技术。

国家农业科技成果转化资金（2012GB2A200030）。