浓香型白酒酿造相关酵母与发酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的相关性

王 涛，李谨萌，游 玲，袁 浩，冯学愚，曹子建，*

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000；2.发酵资源与应用省高校重点实验室，四川宜宾644000；3.成都师范学院，四川成都610041）

浓香型白酒酿造相关酵母与发酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的相关性

王 涛1，李谨萌1，游 玲2，袁 浩1，冯学愚3，曹子建3，*

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000；2.发酵资源与应用省高校重点实验室，四川宜宾644000；3.成都师范学院，四川成都610041）

为探讨浓香型白酒酿造过程中酵母与乙酸乙酯及乙酸生成的关系，将分离自浓香型酿造诸环节的122株酵母分别接种至半固体培养基（入窖粮糟+黄水）中发酵，并设立空白对照和窖内对照，75d后测定糟醅中乙酸乙酯和乙酸的含量。结果显示，122株酵母中能够使糟醅中乙酸乙酯含量高于2个对照的菌株分别有84株和54株，其中乙酸乙酯含量最高可达3.74g/L，为窖内对照的3.94倍；使乙酸含量低于2个对照的分别有120株和15株，其中乙酸含量最低仅为2.03×10-4g/L，仅为窖内对照的0.13%；122株酵母所对应的糟醅中乙酸乙酯、乙酸的浓度间不存在明显的对应关系。

浓香型白酒，乙酸乙酯，乙酸，酵母菌

浓香型白酒的窖内发酵主要依赖于生产环境、曲药、窖泥内众多微生物的参与，微生物的代谢产物、高分子化合物的降解产物及它们之间相互反应的产物构成了白酒的呈香呈味物质，其种类、含量及协调的比例决定了产品品质[1]。乙酸乙酯是浓香型白酒四大骨架酯之一，也是清香型白酒的主体呈香呈味物质[2]。目前对浓香型白酒中乙酸乙酯的相关研究主要集中在生产工艺与原酒中乙酸乙酯含量[3-4]、产乙酸乙酯的功能微生物的筛选及初步应用[5-7]等方面，但对乙酸乙酯在窖内的生成机理研究不够深入。同时，浓香型白酒的各种有机酸中，乙酸含量最高[8]，且是丁酸、己酸及其酯类的重要前体物质[9]，但乙酸含量过高会对发酵中的酵母产生毒害作用，进而影响产品质量[10]。

本文通过对分别接种了分离自浓香型白酒酿造环境的122株酵母并在窖外发酵后的糟醅、空白对照和窖内对照的糟醅中乙酸乙酯和乙酸含量的进行了比较，以期筛选到一些具有生产应用前景的酵母，并在一定层面反映酿造环境中酵母区系与发酵糟醅中生物和非生物因子的互作关系，也为进一步解析浓香型白酒中物质代谢关系提供一些基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料 2008年以来，将分离自浓香型白酒生产企业酿造诸环节的菌株，通过菌落和细胞表观特征去除了冗余的后得到122株酵母，现保存于发酵资源与应用四川省高校重点实验室。其中，分离自糟醅58株、窖房空气38株、曲房空气16株、窖泥4株、大曲6株，经基于26S rDNA D1/D2区的系统发育分析，101株分属于11个属，21株酵母尚未确定其分类地位（结果另发）；乙酸乙酯、乙酸 均为分析纯，郑州谱析公司。

GCMS-QP 2010 PLUS 日本岛津。

1.2 培养基和入窖糟醅制备

1.2.1 培养基 YPD固体和液体培养基。

1.2.2 入窖粮糟 2011年4月采自四川某知名酒企的多粮浓香型入窖粮糟（“跑窖法”工艺，添加了20%曲粉）。

1.2.3 黄水 取自入窖粮糟上一轮发酵的窖池。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化 菌株经YPD活化后，无菌水调整至108个/mL，4℃保存备用。

1.3.2 接种与发酵 在酿造车间内将入窖粮糟和原窖黄水按约50∶1的体积比混匀后，分装至500mL无菌三角瓶中（每瓶装400g糟醅），无菌密封后立即回实验室接种。每株菌接种2瓶（10mL/瓶），以不接种酵母的糟醅为空白对照（2瓶）。三角瓶用橡胶塞及保鲜膜封口后常温遮光发酵75d（发酵时间为4月13日～6月27日）。以同批次正常入窖发酵（75d）的糟醅为窖内对照。

1.3.3 检测样品的制备 每个三角瓶取糟醅200g（糟醅混匀后再取样，每个样处理后单独检测取平均值），窖内对照取样1000g（多点取样、混合均匀），加等体积蒸馏水蒸馏，取100mL馏分用0.22μm细菌滤膜过滤后GC-MS检测，并以1.1466g/L的乙酸乙酯溶液和0.4915g/L乙酸溶液作为标样，以作确认。

1.3.4 GC-MS检测 色谱条件：色谱柱为LZP-930（5000mm×0.25mm×0.25μm）毛细管柱，载气为高纯氦气，柱温50℃（保持3min），以5℃/min的速率升温至150℃（保持5min）；以5℃/min的速率升温至190℃（保持5min），以3℃/min的速率升温至220℃（保持10min）；进样口温度220℃，进样量0.2μL，分流比30∶1。

质谱条件：电离源EI，电子能量70eV；离子源温度200℃，检测温度240℃，溶剂延迟3min，扫描范围30～550amu，倍增电压1.2kV。

2 结果与分析

2.1 糟醅发酵情况

三角瓶中的糟醅发酵结束时呈润湿、均一的黄褐色，无霉菌污染，整体发酵情况良好。对照窖池出窖糟醅和原酒的感官、理化指标均显示窖内发酵糟醅发酵正常。

2.2 发酵糟醅中乙酸含量

经GC-MS检测，空白对照和窖内对照乙酸浓度分别为10.53g/L和0.15g/L，窖内发酵糟醅乙酸浓度与实际生产和文献报道[9]基本一致。这也显示窖内发酵能够显著降低糟醅中乙酸的含量。122株供试酵母中有120株酵母对应的糟醅中乙酸浓度低于空白对照（占供试菌株的98.36%），其中15株对应的糟醅还低于窖内对照（占供试菌株的12.30%）。这表明在浓香型白酒酿造环境中的酵母绝大多数都能够降低发酵糟醅中的乙酸含量。

所有发酵糟醅中，乙酸浓度最高和最低值分别为14.62g/L（为窖内对照的97～98倍）和2.01×10-4g/L（仅为窖内对照的0.00134倍），为分别接种了分离自发酵糟醅和窖房空气的2株Debaryomyces属酵母的糟醅。这显示供试酵母对发酵糟醅中乙酸浓度的影响能力差异巨大，也在一定程度上说明浓香型白酒发酵体系的复杂性。

2.3 发酵糟醅乙酸乙酯含量

窖内对照糟醅中乙酸乙酯浓度为0.95g/L，这与实际生产和文献报道[11]基本一致，且高于空白对照（0.46g/L）。84株（占供试菌株的68.85%）对应糟醅中乙酸乙酯浓度高于空白对照，有54株对应糟醅中乙酸乙酯含量高于窖内对照。同时接种了酵母样品中乙酸乙酯的平均浓度为1.06g/L，为空白对照的2.32倍。这也显示浓香型白酒酿造相关环境中的酵母区系总体上能够促进发酵糟醅产生乙酸乙酯。

同样，供试酵母对发酵糟醅中乙酸乙酯浓度的影响能力也差异巨大。接种了1株分离自曲房空气的Pichia属酵母的糟醅中乙酸乙酯含量最高，达到了3.74g/L，分别是空白对照和窖内对照的8.20倍和3.92倍；接种了1株分离自糟醅的Wickerhamomyces的样品中乙酸乙酯含量最低，仅为4.12×10-4g/L。

2.4 降低（增加）糟醅中乙酸（乙酸乙酯）含量最为明显的酵母

由于供试酵母数量较多，仅选择了对应糟醅中乙酸乙酯浓度最高的10株酵母和乙酸浓度最低的10株酵母进行了分析。

从表1可以看出，10个样品中乙酸乙酯含量最低为2.70g/L，远高于窖内对照（0.95g/L），这显示这些菌株均有在浓香型白酒生产中应用以提高产品中乙酸乙酯含量的潜力。从10株酵母分别分离自窖房空气（5株）、发酵糟醅（4株）和曲房空气（1株），无论从绝对数量还是相对数量来看，分离自窖房的菌株都最多。这显示窖房空气中的酵母对促进糟醅中的乙酸乙酯含量增加有重要的作用，也从侧面反映窖房空气中的微生物区系对于浓香型白酒酿造具有重要作用。但从10株酵母的分类地位来看，能够促进发酵糟醅中乙酸乙酯显著增加的酵母没有种属特异性。从10个样品中乙酸乙酯和乙酸含量的比例来看，糟醅中2种物质的含量没有对应关系。

从表2可以看出，这10个样品中乙酸含量均远低于窖内对照和空白对照。10个样品对应的菌株中分离自窖房空气的最多（4株），其次为糟醅（4株）、窖泥和曲房空气（各1株）。这也在一定程度显示了生产车间空气中的酵母区系通过在摊晾过程接种于糟醅，在窖内发酵中扮演着重要的作用。10株酵母中，Debaryomyces属最多（6株），其余4株分属于Wickerhamomyces（2株），Pichia和Saccharomyces（各1株）。而且10个样品中乙酸乙酯和乙酸含量的比例表现出了比表1更为紊乱的关系。

2.5 糟醅中乙酸乙酯含量与乙酸的关系

图1 每株菌乙酸乙酯含量与对应的乙酸含量的关系Fig.1 Correlation between the content of acetic ester and acetic acid for each strain

图1显示了122株酵母对应的样品中乙酸乙酯和乙酸含量（以乙酸乙酯含量由少到多排序）。图1和表1、表2均显示接种了酵母菌的糟醅中乙酸含量与乙酸乙酯含量没有对应关系。而且窖内发酵糟醅中的乙酸乙酯仅为空白对照的2倍左右，但乙酸含量却仅有空白对照的1.4%。这些都表明浓香型白酒窖内发酵过程中乙酸乙酯的生成途径不仅仅是乙醇与乙酸酯化的结果，还存在其他途径，这些途径可能是窖内乙酸乙酯生成的主要途径。这也与王治国等[12]的研究结果和目前化工工业中合成乙酸乙酯的有多个途径[13]的现实状况是吻合的。

3 讨论

本研究中，尽管糟醅在三角瓶中发酵与在窖内发酵存在较大的差异，但纵观本研究的所有结果，发酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的含量的比值表现出明显的无序性，既在窖内发酵过程中乙酸可能不是乙酸乙酯生成的限制性条件，浓香型白酒中乙酸乙酯的生成可能存在多种途径。但浓香型白酒酿造过程是一个及其复杂的微生物代谢过程，影响因素众多，要探明发酵过程中乙酸和乙酸乙酯的关系尚需通过大量的实验数据进一步验证。

表1 糟醅中乙酸乙酯含量最高的10株酵母Table 1 10 strains produced most acetic ether in fermentation grain

表2 糟醅中乙酸含量最低的10株酵母Table 2 10 strains produced least acetic ether in fermentation grain

相对于窖内对照和空白对照中乙酸乙酯和乙酸的比值（分别为6.33和4.4×10-2），接种了酵母菌的发酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的比值关系变得极为混乱，最低仅为7.43×10-4，最高却达到了9.03×103。这也在相当程度上显示在浓香型白酒窖内发酵体系中强化接种很可能改变窖内发酵体系的均衡，存在较大的风险，需要在对微生物区系及代谢产物的充分认识的基础上应用。

4 结论

所有接种了酵母的糟醅中乙酸和乙酸乙酯含量与空白对照均有较大差异，这表明这些酵母都能够在添加了黄水的入窖糟醅（高酸度中）生长。这些显示经过浓香型白酒（长期）生产所形成的高酸、高醇环境的选择作用，生产环境中的酵母菌均能够适应糟醅的理化环境，并影响发酵糟醅中的生物化学反应。

分离自酿造环境的酵母中，绝大多数酵母可以降低发酵糟醅中乙酸含量、提高乙酸乙酯的含量，而且还有相当部分酵母作用效果显著。其中分离自曲房空气的Z9Y-7-B（Debaryomyces sp.）可使糟醅中乙酸乙酯达到2.11g/L，而乙酸含量却仅为2.3×10-4g/L。这些菌株具有通过强化制曲在浓香型和清香型白酒酿造、利用丢糟和黄水生产乙酸乙酯等方面应用的潜力。

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Correlation between yeast isolated from Luzhiu-flavour liquor brewing environment and the generating of acetic acid and ethyl acetate in fermentation

WANG Tao1，LI Jin-meng1，YOU Ling2，YUAN Hao1，FENG Xue-yu3，CAO Zi-jian3，*
（1.College of Life Science＆Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China；2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin 644000，China；3.Chengdu Normal University，Chengdu 610041，China）

In order to explorer the correlation between yeasts and the generating of acetic acid or ethyl acetate in Luzhou-flavor Liquor fermentation，122 strains isolated from all stage of the fermentation were inoculated in special semisolid medium（prepared with fermentative grain and yellow water，without be sterilized）and fermented for 75 days，then acetic acid and ethyl acetate were detected，the medium not be inoculated and the fermentative grain in the pit were set as the blank control and the normal control respectively.The result showed that 84 strains could enhance the generating of ethyl acetate compared with the blank control and 54 strains stimulated its generating with a highest content of 3.74g/L accounting to 3.94 times the normal control. 120 strains could restrain the generating of acetic acid compared with the blank control，15 strains inhibit its generating，the content of acetic acid was only 2.03×10-4g/L accounting to 0.13%of the normal control，while no clear correspondence between 122 strains of yeast and the generating of acetic acid or ethyl acetate could be deduced based the above results.

Luzhou-flavor liquor；ethyl acetate；acetic acid；yeast

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.033

2013－08－19 *通讯联系人

王涛（1973-），男，硕士研究生，副教授，研究方向：微生物技术。

四川省科技厅支撑计划项目（2010NZ0091，2013SZ0054）；国家固态酿造工程技术研究中心开放项目（GCKF201115）；四川省属高校白酒生产技术创新团队建设计划资助项目；宜宾市科技专项研究项目（2010ZGY016，2011ZJY010）；2012年地方高校国家级大学生创新训练计划项目（201210641102）。