蝎肽抗菌凝胶对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

朱占永 余墨声 刘思洋 赵月强 杨希林 曾凤华 曹志贱

1.武汉大学人民医院烧伤整形外科，湖北武汉430060；2.武汉大学人民医院耳鼻喉科，湖北武汉430060；3.青海省人民医院整形外科，青海西宁810007；4.武汉大学生命科学学院，湖北武汉430070

蝎肽抗菌凝胶对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

朱占永1余墨声1刘思洋1赵月强1杨希林2曾凤华3曹志贱4

1.武汉大学人民医院烧伤整形外科，湖北武汉430060；2.武汉大学人民医院耳鼻喉科，湖北武汉430060；3.青海省人民医院整形外科，青海西宁810007；4.武汉大学生命科学学院，湖北武汉430070

目的研究蝎肽抗菌凝胶对痤疮丙酸杆菌的抑制作用。方法将2种编号的痤疮丙酸杆菌厌氧培养，采用微量稀释法对稀释后的痤疮丙酸杆菌菌株的培养菌液进行药敏试验，向稀释后的菌液中分别加入无菌生理盐水、不同浓度的蝎肽抗菌凝胶和含有氨苄青霉素钠粉针剂的溶液，用酶标仪和显微镜观察其对痤疮丙酸杆菌的抑制作用结果；用平板培养的方法复测蝎肽抗菌凝胶的最小抑菌浓度。结果加入蝎肽抗菌凝胶后的前6组痤疮丙酸杆菌培养溶液和加入含有氨苄青霉素钠粉针剂的溶液中均未发现有痤疮丙酸杆菌的生长，显微镜下也未见有痤疮丙酸杆菌生长，其中蝎肽抗菌凝胶对2种痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度分别为3.125 μg/mL和6.25 μg/mL。结论蝎肽抗菌凝胶对痤疮丙酸杆菌有明显的抑制作用，为临床上寻常型痤疮疾病的治疗提供了可靠的实验依据。

蝎肽；抗菌凝胶；痤疮丙酸杆菌；抑制作用

痤疮作为一种有损容危害的疾病来讲，不仅影响患者的外貌，而且严重影响患者的身心健康，因而有关痤疮治疗方面的研究一直受到较多国内外研究者的关注。许多相关的研究表明，痤疮患者的皮损处和毛囊导管内存在着大量的痤疮丙酸杆菌［1］，因而研究如何抑制痤疮丙酸杆菌在创面的繁殖对临床上治疗痤疮有着非常重要的意义。本研究应用含有蝎肽抗菌毒素小分子多肽的凝胶制剂(歇肽抗菌凝胶)作用于痤疮丙酸杆菌的菌株，观察歇肽抗菌凝胶对痤疮丙酸杆菌的抑制作用，为痤疮的临床治疗提供初步的研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株购自中国典型培养物种保藏中心的2个痤疮丙酸杆菌菌株，(编号AB6919、AB11827)。

1.1.2 试验药物武汉摩尔有限公司提供的歇肽抗菌凝胶临床应用制剂，无菌生理盐水和氨苄青霉素钠粉针剂。

1.1.3 仪器和试剂酶标仪biotech ELX800，显微镜，恒温培养箱，BS110S型电子天平，高压灭菌锅，厌氧发生袋，BHI粉，厌氧发生剂：MGC Anaero Pack.Anaero，厌氧指示剂。

1.2 试验方法

1.2.1 痤疮丙酸杆菌的培养称取37 g生物合成人胰岛素(BHI)粉末溶于1 L水中，灭菌后制成BHI培养基，将两株痤疮丙酸杆菌菌株分别接种到BHI培养基中，在厌氧发生袋中37℃厌氧培养48 h并振摇均匀备用。另取少量菌珠涂于载玻片上，采用革兰染色的方法固定染色，然后将其置于100×100的油镜下执行镜检，镜下可见紫色杆菌，微弯呈棒状或杆状，无杂菌生长(图1)。

图1 痤疮丙酸杆菌

1.2.2 倍比稀释蝎肽抗菌凝胶溶液将两种菌株培养的溶菌溶液稀释100倍(OD600约为0.002)；将1 mg/mL的蝎肽抗菌凝胶溶液进行倍比稀释：取8支灭菌试管并各加入蒸馏水1.0 mL，取蝎肽抗菌凝胶溶液1.0 mL加入第1管中，充分混匀后取1.0 mL加入第2管，以此类推，第8管中取1.0 mL液体并将其弃去(表1)。

表1 药物稀释度和相应药物含量

1.2.3 菌株和药液培养向无菌96孔板中每孔加入上述稀释的含有痤疮丙酸杆菌的溶液80 μL，再加入稀释的药物溶液20 μL，使得药物终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 μg/mL，以80 μL菌液加20 μL无菌生理盐水作为阴性对照。阳性对照是由80 μL菌液加20 μL高浓度(25 μg/mL)的氨苄青霉素钠溶液组成。将上述标本转移入恒温摇床培养箱37℃，250 r/min厌氧培养40～48 h。

1.2.4 细菌生长情况的检测用酶标仪测定每组试管药物与痤疮丙酸杆菌混合后溶液OD600的吸光值。已完全没有光吸收孔的药物浓度作为最小抑制浓度。取没有光吸收的菌液常规行革兰染色后用显微镜检查来证明有无痤疮丙酸杆菌的生长。

1.2.5 最小抑菌浓度的检测采用平板培养复测的方法检测出针对两种型号痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度值。

2 结果

编号为AB6919的菌株培养菌液和6号试管的药液混合培养后，没有发现有光吸收；编号AB11827的菌株培养菌液和5号试管药液混合培养后，也没有发现有光吸收，分别取没有光吸收时的混合溶液常规行革兰染色处理后显微镜下检查时未见有细菌生长；通过平板培养复测的方法得出蝎肽抗菌凝胶对两种菌株内的痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别是3.125 μg/mL(菌株编号AB6919)和6.25 μg/mL(菌株编号AB11827)(图2)。

图2 平板培养复测的方法检测蝎肽抗菌凝胶对2种型号痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度值

3 讨论

痤疮丙酸杆菌属于专性厌氧或微需氧的菌种，同时丙酸杆菌属的革兰阳性类白喉杆菌，是皮肤上的优势菌群。现代研究认为，痤疮丙酸杆菌的生长主要依靠皮脂中的三酰甘油作为营养元素，通过获取其甘油的部分作为自身能量的来源，而去酯化的脂肪酸残留于皮脂中并且含量与细菌的数量成正比，去酯化的游离脂肪酸可明显刺激毛囊皮脂腺开口处上皮的增生和角化过度，另外由痤疮丙酸杆菌本身产生的一些低分子多肽可驱化体内的中性粒细胞，后者产生的水解酶也可使毛囊壁损伤破裂，因而造成上述各种毛囊的内容物溢入到真皮内而引起毛囊周围程度不等的深部炎症并促进皮脂腺过多分泌，使皮脂排泄不畅［1.2］；以上发生在体内的变化明显促进了痤疮丙酸杆菌及其他革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等的繁殖，导致炎症性丘疹、脓疱的产生［3］，因此抑制痤疮丙酸杆菌对治疗寻常型痤疮是相当重要的。随着痤疮丙酸杆菌耐药性问题的日益明显，从而导致了药物疗效的明显降低。目前口服或外用抗生素类药物治疗炎症性损害疗效差的主要原因是患者用药的依从性差、剂量不够、疗程不足、出现革兰阳性菌毛囊炎、痤疮丙酸杆菌耐药和皮脂分泌过多［4］。治疗痤疮使用外用药后，皮损局部药物浓度通常明显高于全身用药，而且皮损周边药物浓度明显低于皮损中央，更易产生耐药性［5］，故在对于治疗痤疮过程中，细菌的耐药性成了一个需要克服的难题。

实验中所用的蝎肽抗菌凝胶是一种新型抗菌凝胶，其有效抗菌成分为蝎毒素多肽，该多肽具有广泛的抗菌谱，能有效杀灭革兰阳性球菌，尤其对耐甲氧西林金葡菌(methicillin.resistant staphylococcus aureus，MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin.resistant coagulase negative staphylococcus，MRCNS)有较强杀灭作用，且不易产生耐药性［6.7］，这些细菌也都是寻常型痤疮的主要致病菌。在实验中证实了蝎肽抗菌凝胶对寻常痤疮的主要致病菌痤疮丙酸杆菌有较强的抑制作用，蝎肽抗菌凝胶对两种菌株内的痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别是3.125 μg/mL (菌株编号AB6919)和6.25 μg/mL(菌株编号AB11827)。结合前面所提到的蝎肽抗菌凝胶制剂针对抑制的细菌不易产生耐药性的优点，可以得出：蝎肽抗菌凝胶在治疗寻常型痤疮方面将具有显著的临床疗效，本实验为寻常型痤疮的治疗提供了可靠的实验依据。

［1］Gollnick H.Current concepts of the pathogenesis of acne［J］. Drugs，2003，63(15)：1579.1596.

［2］Patel M，Bowe WP，Heughebaert C，et al.The development of antimicrobial resistance due to the antibiotic treatment of acne vulgaris：a review［J］.J Drugs Dermatol，2010，9(6)：655.664.

［3］孙兵，吴元辉，庞云龙.寻常痤疮细菌学分析［J］.人民军医，1999，42(1)：48.49.

［4］Tan HH.Antibacterial therapy for acne：a guide to selection an d use of systemic agents［J］.Am J Clin Derm Atol，2003，4(5)：307.314.

［5］Eady EA，Jones CE，Tipper JL，et al.Antibiotic resistant prepionibacteria in acne：need for policies to modify antibiotic usage［J］.BMJ，1993，306(6877)：555.556.

［6］Zhao Z，Ma Y，Dai C，et al.Imcroporin，a new cationic antimicrobial peptide from the venom of the scorpion isometrusmaculates［J］.AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2009，53(8)：3472.3477.

［7］Dai C，Ma Y，Zhao Z，et al.Mucroporin，the first cationic host defence peptide from the venom of Lychas mucronatus［J］. Antimicrob Agents Chemother，2008，52(11)：3967.3972.

The inhibition of scorpion antimicrobial peptide gel on propionibacterium acnes

ZHU Zhanyong1YU Mosheng1LIU Siyang1ZHAO Yueqiang1YANG Xilin2ZENG Fenghua3CAO Zhijian41.Department of Orthopedics,the People′s Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China; 2.Department of Otolaryngology,the People′s Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China; 3.Department of Orthopaedics,the People′s Hospital of Qinghai Province,Xining810007,China;4.College of Life Science,Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China

Objective To research the inhibition of scorpion antimicrobial peptide gel on propionibacterium acnes（P.acnes）.Methods Two kinds of number P.acnes were anaerobic cultivation,diluted bacteria cultivation liquid of the P.acnes did drug sensitive test by the trace dilution method.The sterile saline,different concentrations of scorpion peptide gel solution and sodium ampicillin powder injection solution were added into the diluted bacterium fluid respectively.The inhibition of difference concentrations of scorpion antimicrobial peptide gel on P.acnes by means of Enzyme standard instrument and microscope were observed.Results The first six P.acnes culture solution groups of being add in scorpion antimicrobial peptide gel and sodium ampicillin powder injection had not been found the growth of P.acnes,the growth of the P.acnes had not been observed under the microscope too.The minimum inhibition concentration of the scorpion antimicrobial peptide gel were 3.125 μg/mL and 6.25 μg/mL respectively.Conclusion The growth of P.acnes is obviously inhibited by scorpion antimicrobial peptide gel,this result provides a reliable experimental basis for the clinical treatment of acne vulgaris.

Scorpion peptide;Antimicrobial gel;Propionibacterium acnes;Inhibition

R758.733

A

1673-7210（2014）02（a）-0043-03

2013.11.01本文编辑：张瑜杰)

湖北省武汉市科技攻关资助项目(编号2013 060602010275)。

朱占永(1981.9.)，男，博士，主要从事蝎肽抗菌凝胶抗菌机制的基础和临床研究。

余墨声(1961.11.)，男，硕士，主任医师，主要从事蝎肽抗菌凝胶抗菌机制的基础和临床研究。