脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

袁志坚 何文涓 周红 蒋美玲

1.无锡卫生高等职业技术学校，江苏无锡214028；2.中国药科大学，江苏南京210009

脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

袁志坚1何文涓1周红1蒋美玲2

1.无锡卫生高等职业技术学校，江苏无锡214028；2.中国药科大学，江苏南京210009

目的分离提取脂肪干细胞(ADSCs)，对其进行成脂、成骨的鉴定，并与脂肪颗粒混合移植，观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪，磷酸盐缓冲液清洗，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1 h，离心，取沉淀，用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代，取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定；另取第3代ADSCs用于移植，分为两组：ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组，分别移植于大鼠背部两侧，共移植24只大鼠，分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠，再取出背部脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后，经油红O、茜素红染色呈阳性，移植2周、1个月时，两组取出的脂肪组织的体积变化不大；但移植3个月后，取背部脂肪组织，称重：脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g，而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g，两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P＜0.05)。结论原代分离、培养的ADSCs生长状况良好，具有向成脂、成骨分化的能力，与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高，并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况。

脂肪干细胞；成脂诱导；成骨诱导；移植

脂肪组织的获得快捷、方便，2001年，Zuk等［1］从脂肪组织中分离到了一种具有多向分化能力的干细胞，即脂肪来源干细胞(ADSCs)，有分化为脂肪、成骨、软骨、成肌等能力［2.3］，能够在体外稳定增殖，衰亡率低，少量的组织就可获得大量干细胞，适合大规模培养，是近年来的研究热点之一。单纯脂肪移植很容易出现组织液化吸收、形成纤维囊等问题，这些问题一直没有得到根本解决。本研究引入的ADSCs，具有自我复制和多向分化的能力，能够分泌多种生长因子及细胞因子，所以将ADSCs和脂肪颗粒混合移植［4］，会大大提高脂肪组织移植的存活率，降低液化、纤维化、坏死等不良反应［5.6］，本文就ADSCs辅助脂肪移植进行研究，旨在探索ADSCs在脂肪移植中的良好作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

HH.2恒温水浴锅(国华电器有限公司)；XSP.3CA生物显微镜(上海蔡康光学仪器)。胎牛血清(Gibco，北美)；DMEM培养基(Hyclone，美国)；0.25%胰蛋白酶. EDTA(Gibco，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)；磷酸盐缓冲液(PBS)(KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 3.49 g，加水至1000 mL，pH 7.4)；成脂、成骨诱导液和茜素红染液及油红O(赛业生物科技有限公司)。

1.2 动物

12～14周龄SD雄性大鼠，体质量200～220 g，由中国药科大学动物实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 ADSCs的提取、培养和传代

取大鼠1只，脱颈椎处死，在75%乙醇中浸泡10min后，将大鼠置于超净台上，剪开腹部，取出腹股沟脂肪，用PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的血管，再剪至1 mm3大小的脂肪碎块，加入2～3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37℃恒温水浴消化1 h，然后，加入等体积的含10%血清的DMEM培养基中和胶原酶，1500 r/min离心10 min，弃去上层脂肪，沉淀加含10%血清的DMEM培养基重悬，1500 r/min离心10 min，沉淀加含10%血清的DMEM培养基，分于2个培养瓶中，放于37℃、5%CO2孵箱中培养，每3天换1次液，当细胞长满80%～90%时，1∶2传代。

2.2 ADSCs的冻存与复苏

0.25 %胰蛋白酶.EDTA溶液消化细胞，将ADSCs悬液收集到离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清液，加入冻存液［DMEM培养基.血清.二甲基亚砜(7∶2∶1)］调整ADSCs密度在5×106/mL左右，将含ADSCs的冻存液分至冻存管中，每管1 mL，按下列顺序程序降温：放置4℃冰箱30 min，.20℃冰箱1 h，再于液氮罐中保存。ADSCs复苏时，将ADSCs从液氮中取出，迅速置37℃的温水中晃动，使冻存管中的ADSCs冻存液在1 min内融化，将ADSCs悬液吸到离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加含10%血清的DMEM培养基，吹打均匀，再转移至培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培养。

2.3 ADSCs的成脂、成骨鉴定

将第3代细胞消化接种于6孔板中，用于成脂、成骨实验。

2.3.1 成脂鉴定当细胞汇合100%时，换成成脂诱导液A，3 d后换成维持培养液B，经过成脂诱导/维持3次循环后，用维持培养液再培养1周，进行油红O染色，吸去诱导液，PBS洗3次，加入10%中性甲醛溶液，固定30 min，吸去固定液，加入油红O，37℃染色30 min，再加入PBS洗3次，然后在生物显微镜下观察。

2.3.2 成骨诱导当细胞汇合达75%时，换成成骨诱导液，每3天换液1次，诱导2周后，吸去成骨诱导液，PBS洗3次，加10%中性甲醛溶液固定30 min，吸去固定液，加入茜素红染5 min，然后在生物显微镜下观察。

2.4 ADSCs的移植

第3代ADSCs用0.25%胰蛋白酶.EDTA溶液消化，1500 r/min离心10 min，沉淀用于移植。另取一些脂肪组织剪成1 mm3的脂肪颗粒，分为2组：ADSCs (密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组，脂肪颗粒1.5 mL组，分别移植至大鼠背部皮下两侧，自身对照，并且每3天观察背部脂肪的生长情况，共24只大鼠，术后2周、1、3个月分别处死8只大鼠，将其背部脂肪取出，3个月时，称量取出的脂肪组织。

2.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，行t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.6 结果

2.6.1 ADSCs的培养及传代细胞原代提取接种后，悬浮于含10%血清的DMEM培养基中，呈圆形，24 h后细胞贴壁，72 h后，细胞伸展开来，呈短梭形或多角形，见图1，7～8 d后，细胞长满，呈长梭形漩涡样生长，见图2。

2.6.2 ADSCs复苏后的生长情况ADSCs冻存后复苏，与未冻存前的细胞形态未见明显的区别，都呈长梭形生长，见图3。

2.6.3 ADSCs的成脂、成骨鉴定成脂诱导：成脂诱导后，细胞体积变大，胞内有脂滴产生，油红O染成红色，见图4。成骨诱导：成骨诱导后，细胞变成不规则形状或多角形，细胞体积略微增大，茜素红染成红色，可以见矿化结节，见图5。

2.6.4 ADSCs的移植情况移植后的大鼠，正常饮水，每3天肉眼观察1次脂肪体积的变化，在2周、1、3个月这三个时期分别取得大鼠背部脂肪组织，剪开大鼠背部皮肤展开于两侧，能明显看见皮下移植的脂肪组织，见图6，前2个月脂肪体积有所减小，最后1个月脂肪体积变化不大，结果见图7(A1、A2、B1、B2、C1、C2)。可见，3个月时ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组脂肪组织体积明显大于脂肪颗粒1.5 mL组，见表1。

3 讨论

种子细胞在组织工程中起到核心的作用，同时它也是组织工程的研究基础，组织工程的基本原理是将体外扩增的组织吸附在支架上(生物相容性好，可被机体吸收)，再将此复合物移植入机体的损伤部位，形成新的器官或组织，达到修复功能，然而，许多组织细胞的扩增能力有限，又无法通过少量组织扩增构建大块组织，所以，成体干细胞逐渐进入种子细胞的研究领域。ADSCs来源丰富、成本低、应用范围广泛，可以取材于临床治疗后的副产品且扩增分化能力强，用于自体移植无免疫排斥反应，易于被患者接受，在美容外科方面具有很好的应用前景［7.9］，如皮下组织缺损的填充、瘢痕凹陷的填充、皱纹的填充、乳腺癌手术后乳腺的重建等，另外，还发现其对一些心血管疾病和肝损伤疾病等有治疗作用［10.12］。

图1 短梭形或多角形ADSCs（100×）

图2 长梭形漩涡样ADSCs（100×）

图3 复苏前后的ADSCs（200×）

图4 ADSCs成脂分化（油红O染色，200×）

图5 ADSCs成骨分化（100×）

图6 移植后可见的大鼠背部皮下的脂肪组织

本文围绕ADSCs的原代提取、培养、生物学特性及其定向分化潜能展开研究，而ADSCs原代提取时所获得的是一种混杂的细胞群，而能否获得单一均质的ADSCs将直接影响对ADSCs生物性状的研究以及之后的ADSCs的移植，本实验中是通过3次传代，筛去一些贴壁能力或传代能力差的杂细胞来优化选择ADSCs，第三代的ADSCs将用于与脂肪颗粒混合移植，之后进一步观察移植后的脂肪组织生长情况，研究发现ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的脂肪组织的体积明显大于脂肪颗粒1.5 mL组(P＜0.05)，表明ADSCs能够促进脂肪组织的存活，改善单纯移植脂肪颗粒的坏死、纤维化及液化现象。

图7 不同时段大鼠背部脂肪组织情况

表1 ADSCs加脂肪颗粒以及单独的脂肪颗粒移植3个月后脂肪组织的存活量（±s，n=8）

表1 ADSCs加脂肪颗粒以及单独的脂肪颗粒移植3个月后脂肪组织的存活量（±s，n=8）

注：与脂肪颗粒1.5 mL组比较，*P＜0.05

组别存活量( g )脂肪颗粒1 . 5 m L组A D S C s (密度为5 × 1 07/ m L ) 0 . 9 m L +脂肪颗粒0 . 6 m L组0 . 4 5 5 1 ± 0 . 0 0 2 4 0 . 7 7 9 8 ± 0 . 0 0 3 3*

上述实验结果说明在脂肪颗粒中添加ADSCs能够明显减少脂肪颗粒移植时的液化现象，改善长期效果。首先，ADSCs可以分化为脂肪细胞，补充坏死的脂肪细胞的数量；其次，ADSCs具有多向分化能力可以分化为血管内皮细胞，再通过旁分泌促进血管的新生，从而促进血供的恢复；此外，ADSCs还可以通过旁分泌作用调整组织的局部微环境，减少细胞受到的损伤，提高移植后脂肪组织的存活率。虽然如此，但是移植中ADSCs与脂肪颗粒的最佳比例及它们之间的作用和转归还有待进一步的研究。

本研究初步解决了脂肪移植的一些问题，笔者将继续深入研究，采用荧光标记ADSCs后，再与脂肪颗粒混合移植，移植后取出脂肪组织，在荧光显微镜下观察定位标记的ADSCs，用RT.PCR检测移植物过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达。ADSCs的成脂分化过程复杂，受各种miRNA的影响［13.14］，而miRNA是一种很重要的转录调控因子，因此，可以通过直接或者间接的修饰影响ADSCs脂向分化的转录因子的活性，从而更好地调控ADSCs分化为成熟的脂肪细胞，进一步阐明ADSCs成脂分化的分子调控机制，从而更好地提高细胞辅助脂肪组织移植的成活率［15］。

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Isolation,culture and transplantation of rat adipose-derived stem cells

YUAN Zhijian1HE Wenjuan1ZHOU Hong1JIANG Meiling21.Wuxi Higher Health Vocational School,Jiangsu Province,Wuxi214028,China;2.China Pharmaceutical University, Jiangsu Province,Nanjing210009,China

Objective To isolate and culture the rat adipose.derived stem cells（ADSCs）and to identificate its multipotent differentiation ability and to observe the survival of transplantation of ADSCs with adipose compared with adipose in the back of the rats.Methods Adipose tissue were obtained from inguinal region and washed in PBS,then digested with 0.1%collagenase typeⅠat 37℃for 1 h followed by centrifugation and ADSCs pellet was resuspended in DMEM with 10%fetal bovine serum（FBS）and seeded in flasks,cells at passages 3 were used for adipogenic differentiation and osteogenic differentiation,both sides of twenty.four rats were received subcutaneously 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose and 1.5 mL of adipose,took out the adipose tissue of eight rats after two weeks,one month and three months respectively.Results ADSCs stained positively for oil red.O and alizarin red,two weeks and one month later,the weight of adipose had no difference with each other,however,after three months,the average weight of 1.5 mL of adipose group and the 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose group were（0.4551±0.0024）g and（0.7798±0.0033）g respectively,thus,there were significant differences between the two groups（P＜0.05）.Conclusion ADSCs is in good condition and has adipogenic and osteogenic differentiation ability,ADSCs with adipose can improve the survival and the liquefied of the adipose after transplantation when compared with adipose alone.

Adipose.derived stem cells;Adipogenic induction;Osteogenic induction;Transplantation

R329

A

1673-7210（2014）02（a）-0009-05

2013.10.31本文编辑：卫轲)

江苏省卫生厅科技项目(编号J201117)。

袁志坚(1962.1.)，男，江西赣州人，副教授，副主任中医师；研究方向：中医药。