血管生成素-2及血管内皮细胞因子在星形细胞瘤中表达情况及其相关性研究

王玉亭 周垂贤 王道奎 王金鹏 秦时强

山东省潍坊市人民医院神经外科，山东潍坊261021

血管生成素-2及血管内皮细胞因子在星形细胞瘤中表达情况及其相关性研究

王玉亭 周垂贤 王道奎▲王金鹏 秦时强

山东省潍坊市人民医院神经外科，山东潍坊261021

目的研究血管生成素.2(Ang.2)、血管内皮生长因子(VEGF)在人脑星形细胞瘤中的表达及其与星形细胞瘤恶性程度之间的相关性。方法采用免疫组化方法检测60例人脑星形细胞瘤和12例健康脑组织中Ang.2及VEGF蛋白的表达。实验数据采用SPSS 10.0软件行χ2检验、Spearman等级相关分析，分析它们的表达情况和相关性。结果60例星形细胞瘤组织中有39例(65.00%)出现Ang.2蛋白阳性表达，35例(58.33%)出现VEGF蛋白阳性表达；其阳性表达率均高于健康脑组织(16.67%、16.67%)，且差异有统计学意义(P＜0.05)，随着星形细胞病理分级的提高，Ang.2及VEGF蛋白阳性表达率也逐渐增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。Ang.2与VEGF的表达呈正相关(r=0.8649，P＜0.05)。结论Ang.2和VEGF的表达与星形细胞瘤恶性程度密切相关，且在星形细胞瘤的发生、发展过程中起重要作用。

星形细胞瘤；血管生成素-2；血管内皮生长因子

星形细胞瘤是中枢神经系最常见的原发肿瘤，占颅内原发肿瘤的60%［1］，预后不良。星形细胞瘤无论分化高低均在脑内呈浸润性生长，星形细胞瘤的发生和侵袭是一个多步骤的复杂过程，众多研究已表明肿瘤血管形成在星形细胞肿瘤生长及浸润中起重要作用。

近来研究发现，血管生成素(angiopoietin，Ang)作为新的内皮生长因子家族，共有4个亚型，包括Ang.1、 Ang.2、Ang.3、Ang.4，目前对Ang.1、Ang.2的研究较深入，尤其是Ang.2在肿瘤组织中的表达明显高于周围正常组织，且特异表达于肿瘤边缘的血管重建区，在肿瘤早期血管增生、维持及后期血管增生延续的恶性循环中起重要作用［2］。血管内皮生长因子(VEGF)是一种多功能的细胞因子，其作用包括促进血管内皮细胞增殖、提高血管的通透性、促进血管支持物的生成、抑制肿瘤细胞的凋亡等。

Ang.2及VEGF在其他肿瘤中的相关性已有不少研究，但在星形细胞瘤中尚未研究，本研究主要研究其在星形细胞瘤中的表达情况以及它们之间的相关性。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

人脑星形胶质细胞瘤标本60例，取自潍坊市人民医院脑科医院神经外科2008年1月～2009年10月手术患者的存档蜡块，均经病理证实。患者术前均未接受放疗和化疗，年龄为5～73岁，平均(38.2±7.1)岁，其中，＜40岁27例(45%)，≥40岁33例(55%)；男35例，女25例，男女比例为1.4∶1；肿瘤位于幕上者39例，幕下者21例；肿瘤＞3 cm者19例，≤3 cm者41例；肿瘤全切46例(76.7%)，肿瘤部分切除14例(23.3%)；术前卡氏(KPS)评分＞70分49例(81.7%)，KPS评分＜70分11例(18.3%)。选择颅内深部肿瘤切除术时表浅的脑组织12例作为对照，经病理证实均为健康脑组织；其中，男7例，女5例；额叶4例，顶叶2例，颞叶4例，小脑2例。

参照WHO(2000年)分级标准将患者分为四组：Ⅰ级16例，Ⅱ级15例，Ⅲ级15例，Ⅳ14例。为了便于统计学描述和分析，将Ⅰ、Ⅱ级归为低度恶性肿瘤，Ⅲ、Ⅳ归为高度恶性肿瘤。

1.2 试剂

一抗：鼠抗人Ang.2单克隆抗体(即用型，定位于细胞浆)；鼠抗人VEGF单克隆抗体(即用型，定位于细胞膜和细胞浆)；二抗：通用型PV.6000二步法免疫组化试剂盒。均由京中杉金桥生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 蜡块制备和组织制片

组织标本用10%中性甲醛固定，酒精脱水，用二甲苯将标本做透明处理，并于温箱内将透明组织溶于石蜡内，常规石蜡包埋，用切片机制作4 μm切片标本。

1.3.2 免疫组化方法

将石蜡切片脱蜡，水化组织切片，用3%H2O2去离子水孵育5 min，滴加抗体，应用DAB溶液显色，再用蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片，完成免疫组化PV. 6000二步法。在光学显微镜下，以背景无颜色，细胞浆和(或)细胞膜内被染成棕黄色颗粒作为Ang.2、VEGF蛋白阳性染色(即为阳性细胞)，每张切片观察300个细胞，对阳性细胞进行计数。

1.3.3 结果判断

1.3.3.1 Ang.2蛋白染色结果判定参照相关文献［3.4］采取半定量计数法进行评判，即在高倍镜(400×)下随机记录5个视野，按着色细胞染色强弱计分：阴性为0分，弱阳性(淡黄色)为1分，阳性(黄色)为2分，强阳性(棕黄色)为3分。阳性细胞百分比评价标准：＜10%为0分，10%～＜30%为1分，30%～＜50%为2分，≥50%为3分。根据这两项指标的积分之和分为4级：0分为(.)，1～2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)。

1.3.3.2 VEGF蛋白染色结果判定参照相关文献［5］采取半定量计数法进行评判，染色强度得分标准为：阴性为0分，弱阳性(淡黄色)为1分，阳性(黄色)为2分，强阳性(棕黄色)为3分。阳性细胞百分比评价标准为：＜5%计0分，5%～＜25%计1分，25%～＜50%计2分，50%～75%计3分。上述两项分值相加得0分为(.)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性检验采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang-2蛋白在星形胶质细胞瘤和健康脑组织中的表达

本研究中，健康脑组织与星形细胞瘤中Ang.2蛋白阳性表达率分别为16.67%(2/12)和65.00%(39/ 60)，Ang.2在星形细胞瘤中的阳性表达率明显高于健康脑组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。高级别星形细胞瘤组织中(Ⅲ级+Ⅳ级)Ang.2的阳性表达率明显高于低级别星形细胞瘤组织(Ⅰ级+Ⅱ级)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 血管生成素2蛋白在不同级别星形细胞瘤中的表达情况（例）

2.2 VEGF蛋白在星形细胞瘤和健康脑组织中的表达

本研究中，健康脑组织与星形细胞瘤中VEGF蛋白阳性表达率分别为16.67%(2/12)和58.33%(35/ 60)，星形细胞瘤组织中VEGF的阳性表达率明显高于健康脑组织(P＜0.05)。高级别星形细胞瘤组织中(Ⅲ级+Ⅳ级)VEGF的阳性表达率明显高于低级别星形细胞瘤组织(Ⅰ级+Ⅱ级)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.3 Ang-2与VEGF蛋白表达等级相关分析

Ang.2蛋白的表达与VEGF蛋白表达均呈显著正相关性(r=0.8649，P＜0.05)。见表3。

表2 血管内皮生长因子蛋白在不同级别星形细胞瘤中的表达情况（例）

表3 Ang-2蛋白与VEGF蛋白表达相关性情况（例）

3 讨论

3.1 Ang-2在胶质瘤血管生成中的作用

Ang.2属于酪氨酸激酶受体Tie.2的配基之一。Ang.2与Tie.2结合，能促进内皮细胞生长、肿瘤细胞的生长和血管生成。Ahmad等［6］研究发现，转染Ang.2的移植瘤体积明显增大，血管密度增加，提示Ang.2有促进肿瘤血管生成的作用。目前关于肿瘤生长的最新观点认为［7］，肿瘤生长的早期，肿瘤细胞与宿主共择并形成一个血供较好的血管区，但这些血管并不随肿瘤的生长而增生，而是发生了退化，Ang.2此时也表达增多。其可能的原因是由于瘤细胞生长快，代谢能力强于健康组织，此时机体自分泌Ang.2进行“自杀性防御”，破坏被肿瘤组织占据的血管，以达到阻止肿瘤生长的目的。此时肿瘤组织表现为血管退化，肿瘤细胞凋亡，组织坏死。之后，边缘残余的肿瘤细胞为了生存，在缺氧的环境下，生成大量的VEGF。

Ang.2对新生毛细血管的作用主要表现在，Ang.2一开始通过拮抗Ang.1而破坏肿瘤血管，同时也松解了血管结构，消除血管基底膜和周围细胞对血管形成的限制，并激活了内皮细胞。之后，在残余肿瘤细胞大量分泌VEGF的情况下，对VEGF较敏感的内皮细胞便迅速发生增殖、侵袭和迁徙，新生血管开始芽生。但由于Ang.2的持续高表达拮抗了Ang.1的作用，所以新生的肿瘤血管壁不完整，且渗透性高［8］。本实验研究结果显示，Ang.2、VEGF均在星形细胞瘤中呈高阳性表达(65.00%，58.33%)，且其二者具有高度相关性(r=0.8649)也佐证了这一点。Holash等［9］建立了鼠C6神经胶质瘤肿瘤模型，发现在肿瘤直径＞1 mm时，肿瘤血管的内皮细胞Ang.2可强表达；当肿瘤细胞出现坏死时，在坏死中央的肿瘤血管见Ang.2强表达，在边缘肿瘤中亦可见Ang.2呈强表达。Koga等［10］研究表明，胶质瘤细胞和血管内皮细胞均有Ang.2表达，高级别胶质瘤Ang.2表达阳性细胞数及染色强度均高于低级别胶质瘤。这与本文研究显示的恶性程度高的星形细胞瘤组织Ang.2蛋白表达明显高于恶性程度低的星形细胞瘤组织的表达相一致。

3.2 VEGF在胶质瘤血管生成中的作用

VEGF是一种多功能的细胞因子。近来研究表明，VEGF是新生血管形成的中心调控因子，其主要功能包括：①增加肿瘤细胞的血供。由于肿瘤细胞在快速生长过程中对氧和营养的需求量过大，易导致肿瘤组织内缺血缺氧，而缺氧恰为VEGF最强烈的诱导剂，因而导致VEGF大量分泌，并特异性与VEGF受体相结合，加速血管内皮细胞的增生和分化，促使新生血管生成，以满足肿瘤生长的需求。肿瘤的恶性程度越高、体积越大、转移范围越广及浸润程度越深，则对氧的需求越高，故VEGF的分泌越多，并且二者呈正相关［11］。②VEGF可激活血管内皮细胞基因，增强尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物，并减弱纤溶酶原激活剂抑制物(PAI.1)的表达，进而诱导蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的产生来促进血管的形成［12］，改善癌细胞营养和氧的需求。③VEGF促使血管内皮细胞产生金属蛋白酶.9(MMP.9)，使凝血酶原转化为凝血酶，激活明胶酶原A降解原来的基膜，促使血管形成［13.14］，使肿瘤营养和氧供给加大。④VEGF可通过细胞内钙调节蛋白及磷酸肌酶途径增强一氧化氮合酶(NOS)表达，导致一氧化氮生成增多，进而促进新生血管网建立和管腔的形成［15.16］。大量研究证实，VEGF及其受体在大多数人的肿瘤细胞分泌和表达，它通过不同的途径供应肿瘤营养。Vlom等［17］研究发现，肺癌组织中VEFG高表达，并证实了肿瘤细胞可产生VEGF，VEGF的旁分泌机制和腺、鳞癌组织中VEGF表达程度不同。索新等［18］也发现，VEGF在人脑胶质瘤中高表达。本实验研究结果显示，VEGF在星形细胞瘤中的阳性表达率为58.33%，明显高于正常脑组织，并且随着肿瘤组织病理级别的升高阳性率逐渐上升。这说明VEGF在星形细胞瘤的血管形成中起着重要作用。

总之，本研究结果表明Ang.2及VEGF在星形细胞瘤中发生及恶化过程中起重要作用，可根据其在血管和肿瘤细胞表达的实事，使它作为预测星形细胞瘤预后的标志物在肿瘤血管的分子靶向治疗上发挥作用成为可能。

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Expression and correlation study of angiogenin-2 and vascular endotheliai growth factor in astrocytoma

WANG YutingZHOU ChuixianWANG Daokui▲WANG JinpengQIN ShiqiangDepartment of Neurosurgery,Weifang People's Hospital,Shandong Province,Weifang261021,China

Objective To study the expressions of angiogenin.2（Ang.2）and vascular endotheliaI growth factor（VEGF）in astrocytoma and their correlations with the grade malignancy of astrocytoma.Methods The expressions of Ang.2 and VEGF from astrocytoma in 60 patients and from 12 cases of healthy brain tissues were detected by immunohistochemical method.Data from the experiment were analyzed by SPSS 10.0 using chi.square and Spearman rank correlation,in order to observe the expression and correlation.Results Among 60 patients with astrocytoma,there were 39 cases（65.00%）with Ang.2 protein in positive expression and 35 cases（58.33%）with VEGF protein in positive expression.The positive expression rates in astrocytoma tissue were both higher than those in the healthy brain tissue（16.67%,16.67%）, which displayed significant differences（P＜0.05）.With pathological grading of astrocyte advancing,the positive expression rates of Ang.2 and VEGF gradually increased with statistical difference（P＜0.05）.In addition,there was positive correlation between Ang.2 and expression of VEGF（r=0.8649,P＜0.05）.Conclusion Expressions of Ang.2 and VEGF are closely related with the grade malignancy of astrocytoma,and they play important roles in the occurrence and development of astrocytoma.

Astrocytoma;Angiogenin.2;Vascular endotheliai growth factor

R730.231

A

1673-7210（2014）02（a）-0013-04

2013.11.28本文编辑：程铭)

山东省潍坊市科学技术发展计划项目(编号20112007)。

▲通讯作者