巢式PCR诊断甲真菌病中红色毛癣菌和须癣毛癣菌

杨 静童中胜万 喆陈 伟胡志敏李若瑜∗

巢式PCR诊断甲真菌病中红色毛癣菌和须癣毛癣菌

杨 静1童中胜1万 喆2陈 伟2胡志敏1李若瑜2∗

目的: 评价巢式PCR诊断甲真菌病中红色毛癣菌和须癣毛癣菌的敏感性和特异性。方法:液氮冷冻甲标本，微量法提取DNA，应用特异性引物，巢式PCR方法扩增DNA。结果: 36例直接镜检和培养均为阳性的甲标本，培养显示24例为红色毛癣菌，12例为须癣毛癣菌。巢式PCR中First PCR 34例阳性，34例标本均产生了650 bp目的片段；Nest PCR 32例阳性，32例中有22例标本产生了137 bp的片段，为红色毛癣菌；10例标本产生了102 bp的片段，为须癣毛癣菌。PCR敏感性为88.9%，特异性为100%。结论: 巢式PCR是一种快速、特异和敏感的诊断甲真菌病中红色毛癣菌和须癣毛癣菌的方法。

甲真菌病； 巢式PCR

甲真菌病是指任何真菌引起的甲感染，包括皮肤癣菌、酵母菌、霉菌及混合感染，其中皮肤癣菌约占全部感染的67%～90%，而皮肤癣菌中约80%～90%为红色毛癣菌和须癣毛癣菌。1－3目前国内诊断的主要依据为真菌直接镜检和培养。前者不能鉴定到真菌的种类，阳性率只有50%～70%左右，且对检验人员的技术要求较高。而后者敏感性差、耗时长，培养需至少数天至数周才能判断结果。而镜检和培养相结合的正确诊断率约为50%～75%，4导致1/4至1/2的甲真菌病无法早确诊，甚至误诊，上述问题难以满足临床快速诊断和及时治疗需要。为解决这个问题，我们利用液氮冷冻甲标本，微量法提取DNA，应用特异性引物，巢式PCR扩增DNA的方法，在24 h内对甲真菌病中的主要病原菌(红色毛癣菌和须癣毛癣菌)做出诊断，且敏感性、特异性均较高。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本取自2010年10月至2011年8月武汉市第一医院皮肤科及北京大学第一医院皮肤科临床甲真菌病患者的病甲。实验所用标准菌由北京大学真菌和真菌病研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 取材 取材前先用75%的乙醇消毒局部，然后刮取病变活动部位的甲屑，所得标本分为三部分，一部分用于镜检，另一部分接种于PDA培养基，其余部分置于无菌Ep管中以提取DNA。

1.2.2 临床标本DNA的提取 将装有标本的EP管放置于液氮中冷冻30 s，同时微型研磨棒(中国科学院微生物研究所提供)也在液氮中预冷。将EP管放置于试管架上，快速研磨30 s后再放置于液氮中冷冻30 s，再置于试管架上快速研磨。重复冷冻研磨操作，直到标本被研磨成细匀粉末。大块标本先在研钵内研碎后再放入EP管中冷冻研磨。每个装有标本粉末的EP管中加入蛋白酶K，56℃水浴过夜，其间应轻轻上下倒置数次，使其充分混合。之后采用QIAamp DNA investigator kit所提供的方法抽提DNA。参照菌株也用同一方法提取DNA。

1.2.3 引物的选择与合成 引物采用文献中针对大亚基28S rDNA的基因片段，5外引物(真菌通用引物):上游引物FUPa F1(5’－AAGCATATCAATAAGCGGAGG－3’)和下游引物FUPa R1(5’－GGTCCGTGTTTCAAGACGG－3’)。内引物:红色毛癣菌:上游引物TRUB F1(5’－CGTCGCCCGTGCACTG－3’)和下游引物TRUB R1(5’－GAGCGCGTTCCTCAGTCT－3’)；须癣毛癣菌:上游引物TMENT F1(5’－GTGCTCGTCGCCCGTGT－3’)和下游引物TMENT R1 (5’－GGCTATAAGACGTCCCG－3’)。

1.2.4 PCR扩增 采用巢式PCR检测。首先应用外引物进行第1次扩增(First PCR)，然后进一步应用内引物对第1次扩增的产物进行第2次扩增(Nest PCR)。总反应体系如下:10×PCR Buffer 2.5μL，上游引物(10 pmol/L)各1μL，下游引物(10 pmol/L)各1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1μL，DNA 2μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25μL，加入蒸馏水使体系总体积为25μL。反应条件:预变性，95℃15 min；变性，95℃30 s，退火，第1轮和第2轮反应分别为54℃和56℃30 s，延伸，72℃30 s，共30个循环；再延伸，72℃15 min。

1.2.5 PCR产物回收纯化及电泳 采用切胶纯化的方法。步骤按Thermo公司silica Bead DNA Gel Extraction Kit进行。琼脂糖凝胶电泳:取6μL反应产物，2.5%琼脂糖凝胶，100 v下电泳。

1.2.6 PCR特异性检测 用上述引物同时扩增金黄色葡萄球菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白念珠菌的DNA，以观察反应的特异性。设置阴性对照(以蒸馏水替换模板DNA)和阳性对照(红色毛癣菌和须癣毛癣菌标准菌株)。选择所有扩增阳性的产物进行双向测序。

1.2.7 统计学方法 本实验数据应用SPSS 11.0软件包进行数据分析，阳性率比较采用样本t检验，取P＜0.05为检验水准。

2 结果

本组共收集标本36例，36例标本直接镜检和培养均为阳性。其中24例培养为红色毛癣菌(66.7%)，12例培养为须癣毛癣菌(33.3%)。First PCR 34例阳性(图1、2)，Nest PCR 32例阳性，其中22例标本经PCR扩增可产生约137 bp目的片段，为红色毛癣菌(经测序及培养结果验证)(图3)；10例标本经PCR扩增可产生约102 bp目的片段，为须癣毛癣菌(经测序及培养结果证实)(图4)。PCR检出率为94.4%(34/36)，敏感性为88.9%(32/36)，特异性为100%[本实验所用的真菌通用引物(外引物)可扩增出红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白念珠菌、短帚霉、曲霉等常见的甲真菌，未扩增出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等阴性对照，实验所用的特异性引物(内引物)可特异性的扩增出红色毛癣菌和须癣毛癣菌，未扩增出白念珠菌、短帚霉、曲霉、金黄色葡萄球菌等阴性对照]。

图1 临床甲真菌病甲标本First PCR扩增后电泳图

图2 临床甲真菌病甲标本First PCR扩增后电泳图

图3 临床甲真菌病甲标本Nest PCR扩增后电泳图

图4 临床甲真菌病甲标本Nest PCR扩增后电泳图

3 讨论

甲真菌病是皮肤科常见病，但其正确的诊断却不尽人意。诊断不准确的原因:第一，甲病比较复杂，可以是真菌引起，也可以是细菌、遗传、免疫、外伤等因素引起，也可能是其他疾病伴发甲病变。据调查只有约50%是真菌感染所致，仅根据临床表现诊断甲真菌病容易误诊。第二，真菌学镜检和培养结果是确诊本病的主要依据，但直接镜检和培养的阳性率不高，且前者不能鉴定到真菌的种类，后者敏感性差，耗时。

近年来分子生物学技术已渗透至科学研究的各个领域，其中聚合酶链反应(PCR)技术因具有简便、省时、敏感性高、特异性好等优点，已成功应用于许多学科。PCR的技术有很多，如随机扩增多态DNA分析(RAPD)，6限制性酶切分析(RFLP)，7，8巢式PCR，9，10(GACA)4引物PCR，实时定量PCR(Real－Time PCR)，11，12探针与DNA印迹杂交13等等。这些技术的出现使得真菌感染的早期诊断成为可能，继续提高敏感性和特异性将有可能使它作为临床快速诊断的方法之一。PCR技术已在部分真菌病的分类鉴定和亲缘关系分析中得到应用，14，15但很少用于临床病原真菌的检测与诊断，主要是因为临床标本中真菌DNA提取困难，限制了它的应用。16纯菌中提取DNA较容易，但甲组织由于本身质地坚硬不易破碎，给真菌的破壁带来了困难，再加上甲中其他成分多，病原菌量少且分散，就会导致PCR反应无法得到结果。我们首次应用液氮冷冻的方法，先将甲标本冷冻变脆，再用微型研磨棒研磨，能将甲尽可能地磨碎，促进真菌细胞的破壁，实验证实，此方法大大增加甲真菌DNA提取的量，有效可行。

巢式PCR是指利用两套PCR引物对目的基因进行两轮PCR扩增反应。在第1轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第2轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性(有研究较普通PCR高近百倍)，另又有两对PCR引物与检测模板配对，增加了检测的特异性。故巢式PCR更适合于甲真菌病中少量真菌DNA的扩增。因核糖体小亚基(rRNA)的编码基因保守性强，一般适用于种以上分类水平的研究，大亚基的编码基因中含较多的可变区基因，全序列分析后能用作各分类水平的研究，故本项目采用针对核糖体大亚基28S rRNA的编码基因片段设计出的特异性引物，通过巢式PCR的两次扩增，达到快速准确鉴定甲真菌病病原菌的目的。

本实验应用了真菌通用引物和甲真菌中最常见的两种致病真菌红色毛癣菌和须癣毛癣菌的特异性引物，经实验证实，敏感性和特异性均好(PCR敏感性为88.9%，特异性为100%)。本实验36例阳性标本First PCR后有34例阳性，扩增出红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白念珠菌、短帚霉、曲霉的DNA，未扩出大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA，故First PCR后即可鉴定出是否为甲真菌感染。有2例标本(培养为红色毛癣菌)First PCR无阳性结果，可能系所取的甲标本量太少，DNA没有提出或提出的量太少所致。Nest PCR后有32例阳性，未扩出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌、曲霉的DNA，表明红色毛癣菌和须癣毛癣菌的引物是特异的。仍有2例First PCR阳性但未扩出特异性片段(2例须癣毛癣菌)，是否可能因这2例菌株在种内发生了变异或为其他的亚种，我们进行了测序，发现这2株菌株为趾间毛癣菌的结节变种。本研究所用方法在24 h内即可完成从标本处理至结果判定全过程，且具有较高的敏感性和特异性。但本实验样本例数较少，统计结果可能有偏差，还需进一步增加样本量以得出更为可靠的结论。另外，本实验设计的引物种类较单一，我们将在下一步的研究中设计甲真菌病中其他致病菌的特异性引物，并在大样本的检测中观察结果，使甲真菌病的快速诊断更加严谨和完善。

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(收稿:2013－08－22 修回:2013－10－30)

Nested PCR in the diagnosis of Trichophyton rubrum and Trichophytonmentagrophytes infections in onychom ycosis

YANG Jing，TONG Zhong-sheng，WAN Zhe，et al.Department ofDermatology，First Hospital ofWuhan，Wuhan，430022

Objective:To evaluate the sensitivity and specificity of nested PCR in the diagnosis of T. rubrum and T.mentagrophytes infections in onychomycosis.Methods:Nail specimenswere frozen in liquid nitrogen and the DNA extracted by micro－method.The target fragments were obtained by nested PCR with specific primers for T.rubrum and T.mentagrophytes respectively.Results:The group included 36 onychomycosis specimens，in which the direct examination of the fungi and culture resultswere positive(T.rubrums in 24 and T.mentagrophytes in 12 specimens).In nestPCR，34 specimens in the first PCR and 32 in the nest PCR were detected positive.The all positive specimens detected by first PCR produced 650 bp target fragments.A-mong the 32 nest PCR positive specimens，22 specimens produced 137 bp target fragments for T.rubrum and 10 produced 102 bp target fragments for T.mentagrophytes.The sensitivity of nested PCR was 88.9%and the specificity achieved 100%.Conclusion:This nest PCR is rapid，sensitive and specific in detection of T. rubrum and T.mentagrophytes infections in onychomycosis.

onychomycosis；nested PCR

湖北省自然基金(编号:2011CDB303)

1武汉市第一医院皮肤科，武汉，430022

2北京大学第一医院皮肤科，北京，100034

∗通信作者