五没食子酰基葡萄糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

沈丹蓓 蒋明军

五没食子酰基葡萄糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

沈丹蓓 蒋明军

目的: 确定五没食子酰基葡萄糖对瘢痕疙瘩细胞增殖与凋亡的影响。方法: 用细胞生长实验，细胞周期分析，细胞姬姆萨染色比较五没食子酰基葡萄糖、五倍子单宁酸和秋水仙碱对瘢痕组织成纤维细胞，Hacat细胞和肿瘤细胞在增殖与凋亡方面的影响。结果: 五没食子酰基葡萄糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞和黑素瘤A375细胞的增殖有较强的抑制作用，对成纤维细胞的作用呈时间和剂量依赖性，对HaCat细胞的增殖呈双相作用，低浓度为促进作用，高浓度为抑制作用，可使增殖受抑制细胞的细胞周期发生改变，表现为S期阻滞。凋亡细胞显著增加。结论: 五没食子酰基葡萄糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用，对治疗瘢痕疙瘩可能是一个具有开发潜力的活性物质。

五没食子酰基葡萄糖； 增殖； 凋亡

单宁酸是中药五倍子中的主要活性成分，五倍子单宁酸是一种混合物，包含有数种基本结构相近的化合物，这些化合物在分子量、结构和含量方面不同，使它们的生物活性产生差异。五没食子酰基葡萄糖或原型没食子鞣质(PGG，Beta－1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－D－glucopyranose)分子结构中有5个相同的由核心葡萄糖上的羟基与没食子酸上的羧基缩合成的酯键，结构稳定不易水解，分子量为940，是单宁酸中的主要活性物质，具有抗氧化、抗增殖等作用。1－3在我们以往的研究中发现，五倍子中的单宁酸可以以时间和剂量相依赖的方式抑制异常瘢痕成纤维细胞的体外增殖。本次研究中我们主要观察了PGG和单宁酸对瘢痕疙瘩不同来源细胞在增殖与凋亡方面的影响。探索PGG成为治疗瘢痕疙瘩药物的可能性。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂 五倍子单宁酸由中国科学院江苏省药用植物研究中心袁昌齐研究员提供，PGG由美国迈阿密大学Hagerman教授赠送，秋水仙碱购于昆明制药厂，甲基噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均为Sigma产品，DMEM培养基(HyClone)，胎牛血清(杭州四季青生物制品厂)。

1.2 细胞培养 人黑素瘤A375细胞、人肝癌BEL7402细胞和人皮肤HaCat细胞来源于中科院上海细胞所。细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM培养液中(100 U/m L青霉素，100μg/m L链霉素)，在37℃，5%二氧化碳培养箱中培养。瘢痕疙瘩成纤维细胞、增殖性瘢痕成纤维细胞、结缔组织痣成纤维细胞和正常人皮肤成纤维细胞从我所门诊外科手术切除的标本中分离培养，在无菌条件下按常规组织培养技术培养成纤维细胞，4第3代或第4代细胞用于实验。

1.3 细胞生长实验 用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶消化80%融合的单层培养细胞。调整细胞浓度为5×104个细胞/ml，并接种于96孔培养板，每孔接种100μL。向96孔板中分别加入设定浓度的五倍子单宁酸、PGG和秋水仙碱。每个浓度3个孔，以不加药物的培养物为实验的对照组，同时每种药物的每个浓度均设无细胞对照孔。在37℃，含5%CO2的孵箱中培养72 h后，每孔加入MTT(Sigma)溶液(5 mg/ mL)10μL，37℃继续培养4 h，弃去孔内培养液。每孔加入100μL的DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解。在490 nm波长的酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)上以各自的对照孔调零，测定各孔光吸收值，计算细胞体外生长的细胞存活率(实验组OD/对照组OD)。

1.4 细胞周期分析 用含0.02%EDTA 0.25%胰酶消化80%融合单层培养细胞。接种于25 mL培养瓶，细胞密度为1×105个细胞/cm2。同时加入设定浓度的药物样品，培养48 h后收集1×106个以上细胞，冷PBS洗涤后，75%乙醇固定，PBS洗后加入1 mL PI溶液用流式细胞仪(BD FACSCalibur)测定。

1.5 凋亡细胞的姬姆萨染色 在含药物样品的培养液中培养48 h的细胞和不加药对照组细胞，用PBS洗后调整细胞浓度为106个细胞/mL，取100μL细胞悬液均匀涂布于载玻片上，干后用甲醇固定10 min，晾干。在细胞上滴加姬姆萨染色工作液，室温染色10 min。洗去染液，室温晾干24 h，树脂封片。在普通光学显微镜下观察细胞核形态。

1.6 细胞计数法测定细胞生长 用血细胞计数板计数各实验组的细胞总数。

2 结果

2.1 PGG对成纤维细胞的生长抑制作用 我们分别测定了PGG和单宁酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞、增殖性瘢痕成纤维细胞、结缔组织痣成纤维细胞和正常人皮肤成纤维细胞的体外增殖的影响。发现PGG和单宁酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞有较强的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性，对正常成纤维细胞的抑制作用最小(图1a，1b，1c)。

图1 a:PGG对不同组织来源成纤维细胞增殖抑制；b:单宁酸对不同组织来源成纤维细胞增殖抑制；c:10μg/mL PGG对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的影响

2.2 PGG对HaCat细胞增殖的影响 PGG和单宁酸对HaCat细胞的增殖呈双相作用，PGG在低于5μg/ mL时对细胞的生长为促进作用，高于5μg/m L时对细胞的生长为抑制作用。单宁酸对HaCat细胞生长的促进作用强于PGG，在低于20μg/m L时对细胞的生长为促进作用，高于20μg/m L时对细胞的生长为抑制作用，而秋水仙碱在实验的各个浓度对HaCat细胞的生长均为抑制作用(图2)。

2.3 PGG对肿瘤细胞的作用 PGG对黑素瘤A375细胞的增殖有较强的抑制作用，20μg/mL作用48 h即达细胞生长的半数有效抑制浓度。而在相同浓度下对肝癌BEL7402细胞无抑制作用。单宁酸和秋水仙碱在这一浓度下对A375细胞的作用明显低于PGG(图3)。

图2 不同药物对HaCat细胞体外增殖的影响

2.4 PGG可使细胞周期发生改变 PGG可使瘢痕疙瘩成纤维细胞和A375细胞的细胞周期发生显著改变，减少G0～G1细胞，显著增加S期细胞，使G2～M期细胞降为零。但对人肝癌BEL7402细胞几乎无作用。单宁酸也可使细胞周期发生改变，但作用不及PGG。秋水仙碱可减少G0～G1期细胞，显著增加S期细胞(表1)。

图3 不同药物对A375细胞体外增殖的影响

2.5 PGG可促进细胞凋亡 PGG和秋水仙碱可显著增加凋亡细胞的量，镜下可见经姬姆萨染色的细胞中，经PGG作用的细胞，有大量胞核浓染、染色质浓缩、核仁消失的细胞。经秋水仙碱作用的细胞，细胞的胞核较大，核仁消失(表1，图4a，4b，4c)。

表1 10μg/mL药物样品对细胞周期的作用

图4 a:未加药瘢痕疙瘩成纤维细胞(×200)；b:10μg/mL PGG 48 h后的瘢痕疙瘩成纤维细胞(×200)；c:10μg/mL秋水仙碱48 h后的瘢痕疙瘩成纤维细胞(×200)

3 讨论

目前，国际上对可水解单宁类中的多酚类化合物(包括单宁酸)的药理活性研究主要有:促进细胞凋亡作用，抗氧化作用，抗细胞突变和免疫调节作用。其中与目前瘢痕疙瘩防治策略相关的药理学活性主要是促进细胞凋亡和免疫调节的作用。单宁酸可以时间和剂量相依赖的方式抑制肿瘤细胞在体内和体外的生长和增殖，这一作用主要是因为单宁酸的促细胞凋亡活性。在我们以往的研究中发现，五倍子中的单宁酸可以时间和剂量相依赖的方式抑制异常瘢痕成纤维细胞的体外增殖，抑制细胞分泌胶原蛋白。在同一实验浓度下对异常瘢痕成纤维细胞的抑制作用强于正常对照细胞。在50μg/mL及其以下浓度时对正常人角质形成细胞的增殖有促进作用，但对正常人皮肤黑素细胞的增殖有抑制作用。5，6五倍子单宁酸是一种混合物，包含有数种基本结构相近的化合物，这些化合物在分子量、结构和含量方面不同，使它们的生物活性产生差异。其中，五－间双棓酰－葡萄糖[penta－(m－digalloyl)－glucose]是五倍子单宁酸的代表性结构。其分子结构中含有缩酚酸类酯键(depside bond)，结构相对不太稳定，可水解为PGG和没食子酸甲酯及没食子酸。PGG分子结构中有5个相同的由核心葡萄糖上的羟基与没食子酸上的羧基缩合成的酯键(aliphatic ester bond)，不含有缩酚酸类酯键，结构较稳定，相对不易水解，分子量为940，是单宁酸中的主要活性物质。

秋水仙碱在临床上可用于瘢痕疙瘩的辅助治疗。它通过解聚微管，抑制成纤维细胞增殖，提高胶原酶活性来干扰胶原合成。Blazek等建立的瘢痕疙瘩无胸腺小鼠模型证实了秋水仙碱的治疗作用。7，8在我们以往的研究中发现秋水仙碱对人皮肤成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞的增殖均有较强的抑制作用。5，6

成纤维细胞、HaCat细胞、黑素瘤A375细胞和人肝癌BEL－7402细胞分别来源于中胚层、外胚层、外胚层神经嵴和内胚层，有不同的生物学行为。这些不同来源的细胞在增殖和凋亡方面对药物反应的异同可比较药物作用的特异性，同时推测其毒副作用。本研究中发现PGG对瘢痕疙瘩成纤维细胞和黑素瘤A375细胞的增殖有较强的抑制作用，并且对成纤维细胞的作用呈时间和剂量依赖性；对HaCat细胞的增殖呈双相作用，低浓度为促进作用，高浓度为抑制作用；可使增殖受抑制细胞的细胞周期发生改变，表现为S期阻滞；凋亡细胞显著增加，细胞呈现胞核浓染、染色质浓缩、核仁消失。说明PGG不是一个广谱的细胞毒性物质，它对细胞的作用具有选择性。特别是它对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制增殖促进凋亡的作用。而秋水仙碱对成纤维细胞、HaCat细胞、黑素瘤A375细胞的增殖均有较强的抑制作用。目前临床上缺少一个明确的瘢痕疙瘩的优化治疗方案，缺乏安全有效的治疗药物。我们认为PGG在治疗瘢痕疙瘩方面是一个具有开发潜力的活性物质。

1 Zhang J，Li L，Kim SH，et al.Anti－cancer，anti－diabetic and other pharmacologic and biological activities of penta－galloyl glucose.Pharm Res，2009，26(9):2066－2080.

2 Yi W，Fischer J，Krewer G，et al.Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis.JAgric Food Chem，2005，53(18):7320－7329.

3Huang HC，Lin CL，Lin JK.1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－β－D－glucose，quercetin，curcumin and lycopene induce cell－cycle arrest in MDA－MB－231 and BT474 cells through downregulation of Skp2 protein.JAgric Food Chem，2011，59(12):6765－6775.

4方富德.现代医学实验技巧全书(上).1版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.77－78.

5沈丹蓓，夏隆庆，鞠强，等.五倍子等对体外培养的人皮肤瘢痕组织成纤维细胞生长的影响.中华皮肤科杂志，2002，35 (4):299－301.

6沈丹蓓，夏隆庆.五倍子对角质形成细胞、黑素细胞、成纤维细胞体外增殖的影响.中华皮肤科杂志，2005，38(2):95－97.

7Blazek J，Ottomann C，Muehlberger T.Pharmacological therapy of keloids in an athymicmousemodel.Handchir Mikrochir Plast Chir，2008，40(2):81－87.

8 LawrenceWT.In search of the optimal treatment of keloids:report of a series and a review of the literature.Ann Plast Surg，1991，27(2):164－178.

(收稿:2013－04－10 修回:2013－07－28)

The effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of fibroblasts originated from keloid tissue

SHEN Dan-bei，JIANG Ming-jun.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts.Methods:The impact of pentagalloyl glucose，gallotannin and colchicine on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts，HaCat cells and melanoma A375 cells was determined by cell growth test，cell cycle analysis and Giemsa stainmethod.Results:Pentagalloyl glucose had a relatively strong inhibitory effecton keloid fibroblasts andmelanoma A375's proliferation.It significantly inhibited fibroblast proliferation in a dose－and time－dependentmanner.Ithad dual roles on the proliferation of HaCat.Itenhanced the proliferation in low concentration and an inhibitory effect in high concentration.It inhibited the growth of dermal fibroblasts by interfering with cell cycle progression from S phase to G2/M phase.Cell Giemsa stain showed that there were increase in cells apoptosis.Conclusion:Pentagalloyl glucose can inhibit proliferation and enhance apoptosis of keloid fibroblasts.It can be a potential active substance in the treatment of keloid.

pentagalloyl glucose；proliferation；apoptosis

江苏省自然科学基金(编号:BK2011130)

中国医学科学院皮肤病研究所，南京，210042