毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)耐旱相关cDNA文库中4个候选基因的表达分析

宋晓宏， 沙 伟

(1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 涪陵 408100;2.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161006)

苔藓植物是自然界的拓荒者之一，在长期的进化过程中许多耐旱藓类植物形成了特殊的形态、细胞及大分子等特征，具有很强的耐旱能力，并且在复水过程中可诱导启动恢复机制，如丛本藓(Anoectangium compactum)和土生藓类(Tortula ruralis)，经受几个月甚至几十年的干旱仍能保持生命力［1-2］。国外从20世纪70年代起开始研究苔藓植物抗旱性，其中以土生墙藓研究较多，已有大量关于其应对严重的水分和干旱胁迫的生理学、生物化学、细胞响应及分子生物学的研究［3-6］。毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)是紫萼藓属(Grimmia)中典型旱生植物，生长在向阳的裸岩上，久旱而不丧失生活力，是很好的抗旱资源。本研究从已构建的毛尖紫萼藓耐旱cDNA文库中筛选4个干旱胁迫诱导表达的基因，分析其在干旱及复水条件下的表达模式，试图找到重要的抗旱相关基因，为研究毛尖紫萼藓抗旱分子机制提供初步的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

毛尖紫萼藓采自黑龙江省北部五大连池风景区的老黑山。清洗后在自然光照条件下，保持水分充足，室温培养7～10 d至生理指标［质膜透性、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸含量等］稳定，作为对照材料。然后停止浇水进行干旱处理，依据已有对毛尖紫萼藓干旱及复水过程中抗旱相关生理指标测定结果选择取材范围［7］，分别取干旱 1 d、3 d、5 d，再复水 0 h、0.5 h、1.0 h、6.0 h、12.0 h、24.0 h、36.0 h、48.0 h共11个时间点材料，液氮速冻后－80℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

藓类植物普遍含有萜类、固醇类、酚类等次生代谢产物，使提取的 RNA易于降解。为此在 SDS法［8］基础上加以改进，液氮研磨过程中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和抗坏血酸(VC)粉末，裂解步骤中加入终浓度20%的乙醇，沉淀步骤用1/2体积8 mol/L LiCl和1/2体积75%乙醇，-20℃沉淀30 min。RNA纯化使用RQ1 RNase-free DNas试剂盒。cDNA合成采用Promega公司的M-MLV RT试剂盒，合成方法参照说明书进行。

1.3 候选基因及引物设计

通过生物信息学分析，从毛尖紫萼藓耐旱cDNA文库［9］中选取与活性氧清除、信号转导、代谢、物质转运及离子平衡相关的过氧化氢酶相似基因(GpCAT)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相似基因(Gp-PAK)、H+-ATP酶相似基因(GpATP)和蔗糖合成酶相似基因(GpSuSy)进行表达分析。根据这4个基因的EST序列，结合荧光定量PCR引物设计原则，采用Primer express v3.0软件设计定量PCR引物。引物序列见表1。

1.4 候选基因表达分析

以18SrRNA作为内参基因，设置空白对照，每个反应设置3次重复。分别以对照和11个时间点材料cDNA为模板，采用荧光定量PCR分析各基因在干旱及复水条件下的表达。荧光定量PCR使用TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)试剂盒在伯乐公司的Chromo4荧光定量PCR仪上进行，试验数据采用OpticonMonitor3软件自动分析。

表1 候选基因荧光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescence quantitative PCR primer sequences of the candidate genes

2 结果与分析

2.1 干旱条件下基因的表达

以复水培养7～10 d的毛尖紫萼藓材料中基因表达量作为对照，并定义为1个单位，干旱条件下各基因表达量如图1所示。4个基因在干旱条件下基因表达均上调，干旱5 d时GpCAT、GpPAK、GpATP和GpSuSy基因表达量分别达到对照的3.5、3.7、4.6和3.2倍，说明4个候选基因均受干旱诱导表达。在毛尖紫萼藓抵御干旱的过程中，GpPAK作为信号转导系统的关键酶，通过可逆的蛋白质磷酸化过程在细胞内外形成信号转导途径，完成信号转导过程;GpCAT作为活性氧清除酶系统的一员发挥作用，使细胞免于遭受H2O2的毒害;GpATP调节植物离子及渗透物质平衡;GpSuSy调控蔗糖的合成，从而维持细胞膨压，保证其正常生长。

2.2 复水条件下基因的表达

复水条件下各基因表达量如图2所示。复水初期(0.5至1.0 h)，4个基因均表达下调，但之后表达水平各异。其中，GpCAT基因复水后1.0 h表达水平开始大幅上升并呈波动变化，至复水后48.0 h表达量仍为对照的2倍;GpSuSy基因复水后0.5 h表达水平迅速下降，并逐渐恢复到对照水平;GpATP基因复水后1.0 h表达量大幅上升，复水24.0 h时表达量最高，为对照的7.3倍，干旱5 d的1.6倍;GpPAK基因复水后与其他基因相比在短时间内表达量有较大幅度升高，复水6.0 h表达量最高，达到对照的4.2倍，之后逐渐下降到对照水平。说明并不是所有基因都受复水诱导表达，有些基因可能对毛尖紫萼藓复水后快速恢复生长发挥作 用，并且分别作用于复水后的不同时期。

图1 干旱过程中基因的表达模式Fig.1 Expression profiles of drought stress induced genes during dehydration

图2 复水过程中基因的表达模式Fig.2 Expression levels of drought stress induced genes during rehydrationn

3 讨论

耐旱藓类具有特殊的形态、细胞及大分子等特征，既可以适应缓慢干旱胁迫，又可以抵御快速干旱造成的伤害，复水后几秒钟外部形态特征即可恢复正常，并很快恢复生长，区别在于缓慢干旱后复水生理代谢恢复速度很快，而快速干旱后复水要较长时间恢复。Hinshiri等［10］研究牛舌藓(Anomdonviticu losus)和光萼苔(Porella pltyphylla)时发现，缓慢干旱8～9 d后再复水，两种苔藓的呼吸和光合速率可迅速达到正常水平，积极的碳平衡几乎在瞬间建立。

植物干旱后复水能继续生长也是抗旱性的一种表现，多数复苏植物可以在复水24 h后恢复正常代谢水平［11-12］，并且复水后的基因表达与干旱胁迫时的基因表达是一个连续的过程，很多基因的表达具有连续性，在复水过程中依然起到重要作用［13-14］。耐旱藓类复水时基因表达有很大变化，Oliver等［15-16］对土生墙藓的研究结果表明，复水时蛋白质的合成受到巨大影响，其中25种蛋白质合成终止或大幅度下降，74种蛋白质合成开始或大幅度上升，这2组蛋白质分别被称为Hydrins和Rehydrins。在复水延长期，Rehydrins和Hydrins的合成在恢复至正常水平的过程中也有所不同，在水化后2～4 h内，几乎所有Hydrins的合成达到正常水平，而一些Rehydrins仅合成不到2 h，另一些10～12 h后仍呈上升趋势，24 h后所有蛋白质均达到正常水平［17］。因此也有学者［18］推测，复水早期的Rehydrins蛋白质可能参与修复质膜损伤，而复水延长期间的Rehydrins蛋白质则可能参与细胞器结构和功能的长期恢复过程。本研究中，GpSuSy基因在复水后表达量大幅下降，推测其可能为编码Hydrins的基因;GpPAK和GpATP基因在复水后表达量高于干旱处理，分别在复水6 h和24 h时达到最高，推测它们为编码Rehydrins的基因，主要受复水诱导，在再水化恢复过程中对细胞的质膜氧化损伤及细胞器的结构功能进行修复;GpCAT基因在干旱及复水条件下都有很高的表达量，无法判断其是编码Rehydrins或Hydrins的基因，但证明了毛尖紫萼藓与土生墙藓有类似的特点，干旱及复水条件下某些基因表达具有连续性。

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