siRNA沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞迁移能力的影响

范 芳，庄 海，李长福

(遵义医学院生化教研室，贵州遵义563099)

乙肝病毒(HBV)感染是肝癌的主要致病因素，HBx 在肝癌的发生发展、转移浸润过程中起着很重要的作用［1］。本研究应用RNAi 技术沉默HBx 基因表达，在体外观察HBx 基因对HepG2.2.15 细胞迁移能力及DNA 合成的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系和材料:肝癌细胞系HepG2.2.15(博慧斯生物技术公司);质粒空载体、pSIHBV/X(百奥迈科生物技术有限公司);Lipofectamine2000(Invitation 公司);Transwell 小室(Costar 公司);EdU 检测试剂盒(广州锐博公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及质粒转染:实验分为空白对照组、脂质体组(只加脂质体)、阴性对照组(转染阴性对照质粒)和pSIHBV/X 干扰组(转染质粒 pSIHBV/X)。转染前收集HepG2.2.15 细胞，按2 ×104个/孔接种于24 孔板中，当细胞增殖汇合达60% ～70%时，利用脂质体转染法将pSIHBV/X质粒转入细胞(操作步骤同说明书)，转染后再培养24、48 和72 h。

1.2.2 Real-time PCR 检测HBx mRNA 的表达:细胞总RNA的提取按RNAiso Plus 试剂盒说明书进行，HBx 上游引物为:5'-ATCGGTACCATGGCTAGGTCG-3'，下游引物为3'-GTGGA AGCGGATTAGTACTTAAGAGG-5';内参β-actin 上游引物为:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物为3'-CTAAGTC ATAGTCCGCCTAGAAGCA-5'。各组样品mRNA 表达量经Real-time PCR 仪器检测，PCR 产物作熔解曲线分析，根据Ct值通过公式2－(△△CT)进行相对定量分析，计算HBx mRNA 相对表达量。

1.2.3 Transwell 小室实验:将Transwell 小室放入每孔加500 μL杜尔贝科改良伊格尔(DMEM)培养基的24 孔板中孵育2 h，加入细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。转染24、48 和72 h 后取出小室，放入0.1%结晶紫的染液中染色15 min，用33%的醋酸溶液漂洗，显微镜下观察并计数，每组细胞各取5 个视野，计数每个视野内穿膜的细胞数，计算平均值。

1.2.4 划痕愈合实验:转染前在24 孔板底部用标记笔划5条直线，转染12 h 后，用10 μL 无菌吸头在底部划痕，将两条直线间的细胞用细胞刮清理干净，PBS 清洗2 ～3 遍，37 ℃继续培养24、48 和72 h 后，于倒置显微镜下观察、拍照并记录两水平线间的细胞数。

1.2.5 细胞DNA 合成检测:细胞转染48 h，更换常规培养基并加入1 μL 5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Edu)孵育24 h后，4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 冲洗2 次，0.5% Triton X-100处理细胞，加500 μL 染色反应液，室温避光孵育30 min，加Hoechst 室温避光孵育30 min，PBS 冲洗3 次后封片，在共聚焦荧光显微镜下拍照。每组细胞取5 个视野，用Image Pro Plus 软件计数相同视野下EdU 标记细胞及总细胞数，计算DNA 合成率(DNA 合成率=EdU 标记细胞/总细胞数)。

2 结果

2.1 Real-time PCR 检测HBx mRNA 表达情况:转染pSIHBV/X 24、48 和72 h 后，实验组HBx mRNA 的表达较其他对照组下调(P＜0.05)，pSIHBV/X 组48 和72 h 与空白对照组相比HBx 的沉默效率分别为39.42%和58.97%(图1)。

2.2 Transwell 检测细胞迁移情况:转染24、48 和72 h 后实验组细胞的迁移能力较对照组显著下降(P＜0.05)(图2)。

2.3 划痕实验:转染48 和72 h 后实验组细胞转移数比对照组明显减少(P＜0.05)(图3)。

图1 pSIHBV/X 干扰后HepG2.2.15 细胞中HBx mRNA 的表达Fig 1 Expressions of HBx mRNA in HepG2.2.15 cells after interfered by pSIHBV/X

图2 pSIHBV/X 对HepG2.2.15 细胞迁移的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of pSIHBV/X on HepG2.2.15 cell migration

图3 转染pSIHBV/X 24、48 和72 h 后细胞转移率Fig 3 The number of invasion after transfection pSIHBV/X of 24，48 and 72 hours

2.4 EdU 法检测各组细胞DNA 合成情况:转染pSIHBV/X 48 h 后干扰组细胞DNA 合成率显著低于其他对照组(P＜0.05)(图4)。

图4 转染48 h 后EdU 检测结果Fig 4 EdU results after transfection for 48 hours

3 讨论

本实验通过脂质体转染法将靶向HBx 基因的干扰质粒pSIHBV/X 转染入肝癌细胞系HepG2.2.15 内，结果显示，转染pSIHBV/X 干扰质粒后HepG2.2.15 细胞中HBx mRNA 表达水平与对照组相比明显下降，并能抑制HepG2.2.15 细胞的迁移运动能力，其机制可能与其上调VEGF 和MMP 的表达有关［2］。有研究表明HBx 可通过抑制蛋白降解途径而影响细胞周期［3］。本研究应用EdU 法检测转染pSIHBV/X 质粒后各组细胞DNA 合成情况，结果显示HBx 基因沉默后pSIHBV/X 组DNA 合成率下降，其具体机制还有待进一步深入研究。

［1］Gearhart TL，Bouchard MJ．The hepatitis B virus HBx protein modulates cell cycle regulatory proteins in cultured primary human hepatocytes［J］．Virus Res，2011，155:363-367．

［2］Liu LP，Liang HF，Chen XP，et al．The role of NF-kappaB in Hepatitis b virus X protein-mediated upregulation of VEGF and MMPs［J］．Cancer Invest，2010，28:443-451．

［3］Pandey V，Kumar V．HBx protein of hepatitis B virus promotes reinitiation of DNA replication by regulating expression and intracellular stability of replication licensing factor CDC6［J］．J Biol Chem，2012，287:20545-20554．