陆生伊萨酵母生物降酸酿造树莓干型酒工艺研究

隋韶奕，张素敏，*，文连奎，王雪松

（1.辽宁省果树科学研究所，辽宁营口115214；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

陆生伊萨酵母生物降酸酿造树莓干型酒工艺研究

隋韶奕1，张素敏1，*，文连奎2，王雪松1

（1.辽宁省果树科学研究所，辽宁营口115214；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

以红树莓为原料，利用陆生伊萨酵母（Issatchenkia Terricola）进行生物降酸酿造全汁树莓干型酒。通过正交试验得到了最佳生物降酸条件：陆生伊萨酵母接种量3%、酿酒酵母接种量0.08%、降酸温度为28℃、降酸时间为5 d。经发酵所得树莓干酒色泽为红宝石色，无明显悬浮物，口感圆润淳厚，带有典型的树莓果香及和谐的醇香，无异味。

陆生伊萨酵母；生物降酸；树莓干型酒；工艺研究

树莓（Rubus spp.）又称山莓、覆盆子等，是一种多年生落叶灌木果树，果实属浆果，其色泽艳丽，成串成簇，柔嫩多汁，风味芳香，营养丰富，被赋予“黄金浆果”和“水果之王”的美称。树莓中有机酸含量超过2%，主要为柠檬酸及苹果酸，柠檬酸含量超过总酸的90%[1-5]。

树莓在全世界已有300多年的栽培历史。我国早在上世纪二十年代就由俄罗斯引进树莓，并开始对其进行生产性栽培。截止2008年，中国树莓栽培面积达8 900 hm2，年产量5.5万t[6-7]。树莓果实不耐贮运，除了少量果实被鲜食和速冻外，大部分都要通过加工途径被利用。在食品加工领域，常见的树莓加工品有果汁、果酱、冻干果、果粉等[8]，但是在众多树莓加工品中，干型酒却极为罕见。究其原因是由于树莓本身的有机酸含量很高，以其为原料生产的全汁干型酒酸度大，口感酸涩，不易被广大消费者所认可，而传统的物理、化学降酸方法对树莓酒的营养价值和口感影响较大，随着近年来树莓产量的不断增加，树莓加工品的日益热销，找到一种可应用于树莓干型酒生产中的降酸方法势在必行。

1 材料与方法

1.1 降酸菌株来源及介绍

吉林农业大学农产品加工及贮藏工程实验室筛选出了一株以L-苹果酸和柠檬酸为碳源的酵母菌，鉴定此酵母菌为伊萨酵母属，陆生伊萨酵母种，代号S8。此酵母菌对1.2%以下的柠檬酸和2%以下的L-苹果酸降解率均达80%以上，本研究将采用该菌种运用于树莓酒的生物降酸中。

1.2 材料

红树莓：品种为海尔特兹，辽宁省果树科学研究所提供；白砂糖：市售，符合GB317.7-1991《白砂糖》国家标准要求；水：符合GB5749《生活饮用水卫生标准》要求；果胶酶：天津利华酶制剂技术有限公司提供；高活性酿酒酵母：丹宝利果酒用酵母；壳聚糖及其他试剂：均为国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯或化学纯。

1.3 仪器与设备

SW-CJ-ID型超净工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KYC-1000C型空气恒温摇床：上海新苗医疗器械制造有限公司；其他：培养皿，温度计，滴定管，三角瓶等。

1.4 方法

1.4.1 工艺流程

1.4.2 原料处理

挑选原料树莓，剔除霉烂果后进行破碎，用斐林试剂滴定法测得总糖量为8%，用酸碱滴定法测得总酸量为1.74%。

1.4.3 酶解榨汁

向破碎后的果浆中加入果胶酶，添加量为0.035%，常温下酶解4 h[9]。酶解结束后滤得清汁。

1.4.4 生物降酸

将菌种S8通过活化，一级培养、二级扩陪、三级扩陪得到菌悬液备用；将丹宝利果酒用干酵母，按1∶20投放于30℃温水，在37℃的恒温培养箱活化30min，制成菌悬液备用。

根据单因素试验所得到各试验参数的基本范围，以降酸菌株S8接种量（A），酿酒酵母接种量（B），降酸温度（C），降酸时间（D）为因素进行L9（34）正交试验，以树莓汁中可滴定酸下降量为指标筛选最佳生物降酸工艺参数。

1.4.5 加热杀菌

生物降酸结束后，将发酵液快速加热到70℃后维持20min，以杀灭发酵液中残存的降酸菌及酿酒酵母，然后迅速冷却至室温。

1.4.6 调整成分

干型酒的酒精度一般为12%（体积分数），酿造所需含糖量为20.4%，而本试验中所用试材树莓含糖量为8%，为满足含糖量要求，在本试验试材中添加12.4%的白砂糖。

1.4.7 主发酵

向调整成分后的发酵液中再次接入0.1%[以干酵母重量计]的酿酒酵母，在20℃～25℃条件下进行主发酵。

1.4.8 后发酵

发酵液总糖量低于0.4%时，主发酵结束，通过倒桶，将发酵罐中沉淀物与酒液分离，保持15℃～20℃，发酵15 d～20 d。

1.4.9 澄清

采用壳聚糖作为澄清剂，添加量为0.06%，将壳聚糖用2%柠檬酸配制成1%溶液，浸泡24 h后直接添加进树莓酒中。

2 结果与分析

2.1 最适生物降酸工艺路线的确定

表1 菌株S8特性[10]Table1 The characteristic of S8

本试材树莓总糖含量为8%，成分未经调整的果汁，发酵后可产生的酒精浓度不会超过4.7%，由表1可以看出，对陆生伊萨酵母S8的生长繁殖不会产生抑制作用，而且树莓自身香气成分对热稳定性较好，加热后香气散失并不明显。所以，在本试验中可采用两种降酸方法。方法一，先在树莓果汁中接入降酸菌株S8，待含酸量降至理想范围后加热杀菌，调整果汁成分，再接入酿酒酵母进行酒精发酵；方法二，在树莓果汁中同时接入降酸菌株S8和酿酒酵母，使生物降酸和酒精发酵同时进行，当果汁含酸量降至理想范围内，加热杀菌后调整果汁成分，再次接入酿酒酵母完成后续酒精发酵。

分别采用两种处理方法，考察降酸量及处理后果汁品质，以确定最适生物降酸工艺路线。酿酒酵母接种量[以干酵母计]为0.1%，S8接种量[以菌悬液计]为3%，试验温度为28℃，为菌株S8的最佳接种量及最适培养温度[11]，培养时间为5 d。

图1 不同生物降酸方法的影响Fig.1 The influence of different biological acid-degradation

由图1所示，经过5 d降酸处理，两种方法在降酸量上区别并不明显，但从感官品质上则区别较大，采用方法一的试样带有酸臭异味；采用方法二的试样无异味，树莓香气明显。由此分析，方法二在生物降酸的同时进行酒精发酵，产生的酒精可在一定程度上抑制杂菌的生长，而且较方法一缩短了酿造时间，节约了生产成本，因此，确定方法二为最优降酸工艺路线。

2.2 S8接种量对生物降酸的影响

将接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%的S8菌悬液（＞106cfu/mL）接入树莓汁中，同时接入接种量（以干酵母重量计）为0.1%的酿酒酵母，28℃下降酸发酵4 d后，分别测定其降酸量。

图2 S8接种量对生物降酸的影响Fig.2 Effect of S8 inoculation on the biological acid-degradation

由图2所示，随着S8接种量的增加，降酸量逐渐增大，但当接种量超过3%后，提高接种量对降酸量的影响不大，考虑到生产成本以及对树莓酒口感的影响，优选出3个接种量分别为2%、3%、4%进入正交试验。

2.3 酿酒酵母接种量对生物降酸的影响

将接种量为3%的S8菌悬液（＞106cfu/mL）接入树莓汁中，同时接入接种量（以干酵母重量计）分别为0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%的酿酒酵母接入树莓汁中，28℃下降酸发酵4 d后，分别测定其降酸量。

由图3所示，酿酒酵母接种量越小，降酸量越大，但当接种量为0.04%时，发酵液中有杂菌产生，说明酿酒酵母添加量过小，产生的酒精浓度不足以抑制杂菌的生长。当接种量超过0.08%时降酸量呈现下降趋势，当接种量达到0.1%后降酸量下降明显，说明酿酒酵母接种量过大导致发酵速度加快，提高了酒精浓度的升高速度，过早的抑制了降酸菌S8的活性，从而影响了降酸效果。根据上述结果，优选出3个酿酒酵母接种量分别为0.06%、0.08%、0.1%作为正交试验水平。

图3 酿酒酵母接种量对生物降酸的影响Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculation quantity on the biological acid-degradation

2.4 温度对生物降酸的影响

将接种量为3%的S8菌悬液（＞106cfu/mL）接入树莓汁中，同时接入接种量（以干酵母重量计）为0.1%的酿酒酵母，分别在24、26、28、30、32℃下降酸发酵4 d后，分别测定其降酸量。

图4 温度对生物降酸的影响Fig.4 Effect of temperature on the biological acid-degradation

由图4所示，在培养温度为24℃时，降酸量较低，随着培养温度的上升，降酸量也增大，当培养温度为28℃时，降酸量趋于平缓，当温度升高到30℃以上时，降酸量随即下降。根据上述结果，优选出3个培养温度分别为26、28、30℃进入正交试验。

2.5 时间对生物降酸的影响

将接种量为3%的S8菌悬液（＞106cfu/mL）接入树莓汁中，同时接入接种量（以干酵母重量计）为0.1%的酿酒酵母，28℃下降酸发酵2、3、4、5、6 d后，分别测定其降酸量。

由图5所示，随着降酸时间的增加，降酸量逐渐增加，但当降酸时间超过4 d后，发酵液中可作为降酸菌S8碳源的葡萄糖已经基本被消耗掉，其他碳源L-苹果酸和柠檬酸的浓度也已经降低，而且乙醇发酵所产生的酒精浓度不断增大，已经开始对S8产生抑制，导致降酸菌数量下降，降酸能力减弱，降酸量趋于稳定。考虑到节约时间成本，优选出3个降酸时间分别为3、4、5 d作为正交试验水平。

图5 时间对生物降酸的影响Fig.5 Effect of time on the degradation of acid

2.6 树莓酒生物降酸正交试验结果与分析

表2 正交试验结果Table2 Results of orthogonal test

表2中R值表明：陆生伊萨酵母S8对树莓酒生物降酸试验中，影响降酸量的最大因素为D，各因素影响的主次顺序为D＞C＞B＞A，以降酸量为指标，最佳条件组合为A2B2C2D3。此处理未在正交试验中，为此又做了验证性试验，如表3所示。

表3 验证性试验结果Table3 Results of confirmatory trials

在该条件下测得降酸量为1.13%，高于正交试验组最佳组合A2B1C2D3的降酸量1.1%，因此陆生伊萨酵母S8对树莓酒生物降酸的最佳工艺条件为：A2B2C2D3，即S8接种量为3%、酿酒酵母接种量为0.08%、降酸温度为28℃、降酸时间为5 d。

由正交试验结果可以看出，接入陆生伊萨酵母S8后，降酸时间越长，降酸量越大，尤其在S8生长到达稳定期后，表现会更为突出，因此降酸时间在树莓酒生物降酸试验的各因素中影响最大。温度对菌株S8活性的影响是决定性的，温度过高会导致S8因疲劳而死亡，温度过低则会使S8的活性降低，对降酸效果产生影响。酿酒酵母接种量的大小，会对菌株S8的生长产生影响，酿酒酵母接种量偏大，会在接种初期，与同处于对数生长期的陆生伊萨酵母S8争夺生长所需的碳源和氮源，而且会提高产酒精的速度，过早的抑制了S8的活性。

3 结论

本试验以新鲜红树莓海尔特兹为原料，以吉林农业大学农产品加工实验室筛选保存的陆生伊萨酵母菌株S8作为降酸菌，通过生物降酸酿造优质树莓干型酒，在S8接种量（以菌悬液计）为3%、酿酒酵母接种量（以干酵母重量计）为0.08%、降酸温度为28℃、降酸时间为5d的条件下，树莓酒中可滴定酸含量下降1.13%。最终经过发酵得到酒精度11.6%（体积分数，20℃），总糖2.35 g/L，色泽为红宝石色，带有典型果香的树莓干型酒。

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Use Issatchenkia Terricola Brewing Technique of Raspberry Wine by Biological Acid-degradation

SUI Shao-yi1，ZHANG Su-min1，*，WEN Lian-kui2，WANG Xue-song1
（1.Liaoning Institute of Pomology，Yingkou 115214，Liaoning，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

Research using the red raspberry as material and Issatchenkia Terricola as de -acidification yeast during brewing of pure juice wine， the following results were achieved or recorded. We came to a conclusion of the optimum acid -degradation condition by the single factor trial and orthogonal test： Issatchenkia Terricola inoculum size was 3 %， the Brewers yeast inoculum size was 0.08 %， the temperature of de-acidification was 28℃，and de-acidification time was 5 d. Product quality index of raspberry wine is as follow： its colour was ruby， with no obvious suspensions， The palate stable， with a typical aromas of raspberries and harmonious flavour.

Issatchenkia Terricola；biological acid-degradation；raspberry wine；technical study

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.013

2013-04-10

辽宁省科技厅（20102223）

隋韶奕（1981—），男（汉），助理研究员，硕士，研究方向：果品贮藏加工。

*通信作者：张素敏（1972—），女，助理研究员，硕士，研究方向：有效物质提取。