响应曲面法优化纤维素酶辅助提取黑米花色苷研究

刘永吉，刘国凌，黄前娣，郭红辉

（韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关512005）

响应曲面法优化纤维素酶辅助提取黑米花色苷研究

刘永吉，刘国凌，黄前娣，郭红辉*

（韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关512005）

在单因素试验的基础上，利用响应曲面法对纤维素酶辅助乙醇浸提黑米皮花色苷提取工艺参数进行优化研究。选择酶解温度、酶用量和酶解时间为自变量，花色苷提取量为响应值，采用Box-Behnken设计方法，研究各自变量及其交互作用对花色苷提取率的影响。利用Design Expert7.0软件对数据进行回归分析，得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明，纤维素酶辅助提取黑米花色苷的优化工艺条件为：加酶量为2.0%，酶解温度为38.7℃，酶解时间为128.8min，料液比为1∶10，浸提时间为40min，浸提温度为50℃，乙醇浸提液浓度为80%，在此条件下，黑米皮中花色苷的提取量理论值达21.9mg/g。

黑米；花色苷；纤维素酶；响应曲面法；Box-Behnken设计

花色苷是广泛存在于自然界的一种植物多酚，属于水溶性黄酮花色素甙类化合物，大多数植物花朵及果实所呈现的丰富色彩都与花色苷类物质有关[1]。花色苷类色素除了赋予植物丰富的色彩外，大量的研究证实花色苷还具有抗氧化、抗炎、调节血脂、抗突变及抗肿瘤等生理保健作用[2]。此外，花色苷作为一种较为安全的天然色素，在食品工业也显示出了广阔的应用前景[3]。黑米是一种花色苷含量较高的谷物，来源广泛，然而自然状态下，花色苷与其他辅助物质（共色素、糖类、氨基酸等）共存，难以提取。因此，很有必要对黑米花色苷的分离和提取条件进行优化研究。

1 材料及方法

1.1 材料

用精米机磨取黑米糙米外层约10%种皮得到黑米皮作为提取原料。纤维素酶：日本Wako公司生产（活力≥10U/mg）；无水乙醇、盐酸、氯化钾和乙酸钠均为市售分析纯。主要仪器设备有电热恒温水浴箱、干燥箱、电子分析天平、高速台式离心机、数显酸度计和可见分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 乙醇法提取黑米皮花色苷条件的优化

称取0.2 g黑米皮，分别选择不同的浸提时间、温度、乙醇浓度和料液比等提取条件，经浸提、离心、定容、静置后用分光光度计测定吸光度并计算其含量[4]。

根据T Fuleki的研究，结合比耳定律公式A= εbc，采用如下公式计算黑米皮中花色苷提取量[5]：

式中：X为黑米皮花色苷含量，（mg/g）；ΔT为吸光值；V为稀释体积，L；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量（M=449.2）；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（ε=26 900）；m为样品质量，g。

1.2.2 酶法辅助提取黑米皮花色苷条件的优化

根据上述研究建立的乙醇浸提最优条件，在浸提之前，加入纤维素酶辅助提取，选择加酶量、酶解温度和酶解时间作为试验因素，进行单因素试验，确定最佳酶解条件。在单因素试验的基础上选择对响应值（花色苷提取量）有显著影响的因素。利用Design Expert7.0软件对试验数据进行回归分析，每一变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，模型选用二次方程：

其中Y为响应值，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33为方程系数，X1、X2、X3为自变量编码值。

2 结果与讨论

2.1 乙醇法提取黑米皮花色苷的最优条件单因素正交试验水平设计见表1。

表1 乙醇法提取黑米皮花色苷正交因素水平设计Table1 Orthogonal array of anthocyanin extracted from black rice pericarp by ethanol solutions

对浸提时间、浸提温度、浸提液浓度、料液比进行L9（34）正交试验，方差分析见表2，结果表明，D高度显著，其次分别为C、B、A，通过比较Kij值，可确定各因素的最优水平为A2、B2、C3、D1，最优水平组合A2B2C3D1。即浸提时间为40min，浸提温度为50℃，浸提液浓度为80%，料液比为1∶10，此时，黑米花色苷的提取量为16.5mg/g。

表2 乙醇法提取黑米皮花色苷正交试验方差分析Table2 Variance analysis of anthocyanin extracted by ethanol solutions

2.2 纤维素酶辅助提取黑米皮花色苷的最优条件

2.2.1 单因素试验

各因素对花色苷提取量的影响见图1。

图1 不同酶解条件对黑米皮花色苷提取量的影响Fig.1 Influence of enzymolysis conditions on anthocyanin yield from black rice pericarp

最优酶解条件为加酶量为2.0%时黑米皮花色苷提取量基本达到最大值，酶解温度为40℃，酶解时间为120min。

2.2.2 响应曲面法分析因素的选取及分析

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案[6]，分别以加酶量、酶解温度和酶解时间对应3个独立变量X1、X2、X3，并以-1、0、1分别代表变量的水平。实验因素水平及编码见表3，表中X1、X2、X3为变量的编码值，黑米花色苷的提取量Y为响应值见表4，利用Design Expert7.0软件对数据进行多元回归拟合，得到多元二次回归模型：

表3 试验因素水平及编码Table3 Experimental factors，levels and codes

表4 Box-Behnken设计方案Table4 Box-Behnken design arrangement

回归模型系数的显著性检验见表5，模型一次项X1、X3较显著，X2不显著；二次项X22、X32极显著，X12不显著；交互项X1X3、X2X3显著，X1X2不显著。表明各因素对花色苷提取量的影响不是简单线性关系。

表5 回归模型系数的显著性检验Table5 Significance test of the regression model coefficients

2.2.3 响应曲面分析与优化

根据回归分析的结果，作出模型的响应曲面图和等高线图，结果见图2～图4。

当酶解时间为120min时，加酶量与酶解温度对花色苷提取量的影响见图2，花色苷提取量随着加酶量的增加而增大，随着酶解温度先增大后减小。

图2 加酶量与酶解温度对花色苷提取量影响的响应面图（a）及等高线图（b）Fig.2 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by enzyme amounts and reaction temperature

图3 加酶量与酶解时间对花色苷提取量影响的响应面图（a）及等高线图（b）Fig.3 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by enzyme amounts and reaction time

图4 酶解温度与酶解时间对花色苷提取量影响的响应面图（a）及等高线图（b）Fig.4 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by zymolysis time and temperature

当酶解温度为40℃时，加酶量与酶解时间对花色苷提取量的影响见图3，花色苷提取量随着加酶量的增大而增大，而随着酶解时间先增大后减小。酶解时间对花色苷提取量的影响较大，表现为较陡的曲线；加酶量对花色苷提取量的影响较小，表现为较平缓的曲线。

当加酶量为1.75%时，酶解温度与酶解时间对花色苷提取量的影响见图4，花色苷提取量随着酶解温度和酶解时间的增大先增大后减小，酶解时间对黑米花色苷提取量的影响较大，表现为较陡的曲线；酶解温度对黑米花色苷的提取量影响较小，表现为较平缓的曲线。

利用Design Expert 7.0软件可以确定最佳点的值：加酶量为2.0%，酶解温度为38.7℃，酶解时间为128.8min，在此条件下，花色苷的提取量理论值达21.9mg/g。

3 结论

根据上述两种方法的最佳提取量可知，利用纤维素酶辅助提取黑米中的花色苷比乙醇法提取的花色苷增加率为：A=[（21.9-16.5）/21.9]×100%=24.7%。

因此，利用纤维素酶辅助提取黑米中的花色苷比乙醇法提取的花色苷的量大，其提取效率增加24.7%。纤维素酶作用于黑米皮细胞壁，使细胞壁软化、膨胀及崩溃，从而促进花色苷的溶出，提高黑米花色苷的提取量。

[1]王璐,王振宇,李小雨.花色苷的分离鉴定及生物活性综述[J].食品工业科技,2012,33(3):395-399

[2]郭红辉,凌文华.黑米花色苷研究进展[J].食品研究与开发,2008, 29(3):133-135

[3]张晴．黑米色素提取精制工艺的研究[J]．青岛大学学报,2000,15 (2):24-26

[4]刘洪海,张晓丽,杜平,等.pH示差法测定烟73葡萄中花青素含量[J].食品添加剂,2009,34(9):111-117

[5]杨兆艳.pH示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究[J].食品科技,2007,23(4):201-203

[6]李晓军,潘宏利,陈花,等.响应曲面法优化超声辅助提取金银花总黄酮[J].陕西师范大学学报:自然科学版,2009,39(2):82-90

Cellulase-assisted Extraction of Anthocyanins from Black Rice and its Optimization by Response Surface Method

LIU Yong-ji，LIU Guo-ling，HUANG Qian-di，GUO Hong-hui*
（Henry Fok School of Food Science and Engineering，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

In this study， we used the response surface method on the base of single factor test， to optimize the extract process of cellulase-assisted extraction of anthocyanins from black rice. The enzymes dosage， enzymolysis time and temperature are studied with Box -Behnken design， the interactive effect on the influence of anthocyanins extraction was also predictive model of polynomial quadratic equation is by Design Expert 7.0 software. We chose the best solution as follows： 2.0 % adding amount of enzyme， enzymolysis time of 128.8 min at 38.7℃， solid-liquid ration for 1 ∶ 10， extracted for 40 min at 50 ℃ in 80 % ethanol solution. Under the optimized condition， the predicted extraction rate of the anthocyanins from the black rice pericarp is 21.9 mg/g.

black rice；anthocyanins；cellulose；reponse surface methodology；Box-Behnken design

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.007

2013-03-15

国家自然科学基金项目（81172655）；广东省高等学校高层次人才项目（2011-128）

刘永吉（1983—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品生物活性成分。

*通信作者：郭红辉（1977—），男（汉），教授，博士，研究方向：营养与食品卫生学。