痛情绪反应量化方法的探索*

张肖怡兰坤冯晓璞宋瑞瑞张策张宇

痛情绪反应量化方法的探索*

张肖怡①兰坤②冯晓璞①宋瑞瑞③张策①张宇①

目的：在经典的formalin诱导的条件位置回避模型的基础上，结合本实验室条件探索一种新的痛情绪测量。方法：完全弗氏佐剂（CFA）诱导的条件性位置回避。方法：雄性SD大鼠左侧足底皮下注射完全弗氏佐剂，建立条件性位置回避（CPA）模型。结果：SD大鼠足底皮下注射CFA会引起持续的炎性疼痛，可以产生稳定的条件性位置回避。足底注射生理盐水（NS）组和空白对照（naive）组不能产生条件性位置回避。结论：CFA诱导的CPA模型可以作为痛情绪量化的一种方法。

完全弗氏佐剂； 条件性位置回避； 持续性炎性痛； 痛情绪； 大鼠

国际疼痛研究学会（IASP）曾定义“疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情绪体验”。说明疼痛包含两种成分：即痛的感觉分辨（sensory discrimination）和痛的情绪反应（affective dimensions）。前者主要编码和感受刺激的属性，包括刺激的性质、强度、位置等；后者指痛的情绪、情感特性，涉及编码伤害性刺激所引发的厌恶、焦虑、恐惧等负性情绪。在过去的几十年中，对痛感觉成分的研究在整体、细胞、分子和基因等各个层次上获得了大量成果，针对这些成果也设计成许多新药，但大都疗效有限，往往还产生较大的副作用。一些报道表明，慢性疼痛常常伴有患者的情绪障碍，如孤独、恐惧、焦虑、甚至厌世等给患者带来的身心伤害远比疼痛本身更为严重，也受到了研究者的广泛关注[1-3]。这说明痛情绪反应在慢性持续性疼痛过程中起着非常重要的作用。但对于痛情绪的研究，由于实验方法和动物模型的限制，进展十分有限。

2001年，Johansen等[4]采用条件性位置回避装置最早在啮齿类动物上分离出了行为意义上的痛情绪。此后学者们也越来越多的采用条件性位置回避装置（conditioned place avoidance，CPA）来衡量和量化痛情绪。在国内，Gao等[5]根据Johansen等[4]的研究成功复制了formalin诱导的条件性位置回避模型，多数采用4～6 d的训练方法。除了formalin被用作疼痛模型的致痛物质外，完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant，CFA）也常被用在持续性炎性疼痛的模型中。笔者实验室根据前者formalin诱导的条件位置回避模型研究的经验，建立了简便、有效，实验周期更短的CFA诱导的条件位置回避模型。

CFA是一种油包水的乳浊液，能够非常有效地诱导产生高滴度的抗体。它含结核分枝杆菌的细胞壁成分，可以加强对抗原的抗体反应。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应，注射入哺乳动物皮下之后，会产生炎症和疼痛。大鼠足底注射CFA是一个被广泛应用的慢性炎性痛模型，进行炎性痛相关机理的基础研究[6]。在注射CFA后，动物局部会出现较长时间的红、肿、热、痛等炎症反应以及对热刺激或机械刺激反应敏感的特征。根据相关文献[6-7]和本实验之前的研究发现，CFA导致的热痛敏的高峰出现在注射后2～6 h，并持续约1～2周左右，是种良好的持续性炎性痛模型。因此，笔者考虑把CFA慢性痛模型和条件位置回避结合起来，建立完全弗氏佐剂诱导的条件性位置回避模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取21只雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，重量250～270 g，均由山西医科大学实验动物中心提供。大鼠分笼饲养于动物房内，室温控制在（22±1）℃，12～12 hrs昼夜循环光照。正式实验开始前3～5 d大鼠先初步适应实验室环境。将所有大鼠分为空白对照组（naive）6只、足底皮下注射生理盐水组（NS）7只和足底注射CFA组（CFA）8只，各组大鼠的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试剂和药品 完全弗氏佐剂（sigma）和生理盐水1：1混合试剂

1.3 实验仪器和设备 笔者结合以往的研究及本实验室的条件，改进出条件位置回避的装置[8-10]。如图1所示，具体装置为一有机玻璃材质的长盒（长60 cm，宽15 cm，高25 cm），平均分为两个室，中间用可抽取的有机玻璃材质的门阻隔。一个室外三面贴有间隔一致红色水平条带，底部为3 mm×3 mm孔径的钢丝网眼；另一个室外三面贴有间隔一致的蓝色垂直条带，底部为6 mm×6 mm孔径的钢丝网眼；中间的隔板门分别贴有同侧隔室一致的条纹，贴有蓝色垂直条纹的室外挂有一个小LED灯，亮度为能够使同侧的隔室有微弱的亮光，这样建立的两个相对独立的环境让大鼠在视觉和触觉上会有明显差别，但不会使大鼠出现明显的环境偏好。整个装置放在比较安静、光线暗的环境中，远离装置1 m远处有个15 W的灯，保持环境光线的稳定。在装置的顶部装有红外摄像头，与外部的电脑相连，这样可以记录大鼠在实验阶段的运动情况。完成后电脑系统自动可以分析大鼠在两侧装置中停留的时间。

其中两室随机作为“疼痛环境”适应区和“非痛环境”适应区，中间的挡板可抽取。

1.4 实验设计 由CPA诱导的条件位置回避实验过程分为3 d。

1.4.1 第1天 Pre-conditioning Day将装置中间的隔板取出，让大鼠在装置中自由活动10 min，分别记录大鼠在两室中停留的时间。

图1 条件位置回避装置

1.4.2 第2天 Conditioning Day将装置中间隔板插入，将整个装置分隔成两个相对独立的室，将大鼠任意放入其中一个室中，为“非痛环境”适应区，自由活动30 min。之后将大鼠取出放回饲养笼，30 min后给大鼠左侧足底皮下注射0.08 mL的CFA，其中CFA和生理盐水1：1混合均匀。2 h后，将大鼠放入另外一个室，为“疼痛环境”适应区。在自由活动30 min后，把大鼠取出，放回饲养笼。

1.4.3 第3天 Post-conditioning Day装置中间隔板取出，大鼠在装置中自由活动10 min，分别记录大鼠在两室中停留的时间。

在实验过程中，每次实验结束后用75%的酒精擦洗整个装置。如果大鼠第3天在“痛环境”匹配室所停留的时间少于第1天在该室停留的时间，且有统计学差异，则说明大鼠产生了条件性位置回避（CPA），也说明CFA诱导的条件性位置回避模型成功建立。用大鼠第3天在“痛环境”停留的时间减去第1天在该室停留的时间，其差值称为回避分数（CPA Score），其数值的绝对值大小代表了CPA的程度，回避分数越大，表示回避程度越大，证明痛情绪越明显。

1.5 统计学处理 采用GraphPad Prism 5软件对数据进行分析和作图，计量资料用（±s）表示，大鼠在“痛环境”匹配室的前后停留时间时间进行配对t检验，组间比较进行非配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

空白对照组和足底注射NS组大鼠第3天在“疼痛环境”匹配室的时间与第1天比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；足底注射CFA后，大鼠第3天在“疼痛环境”匹配室的时间明显少于第1天，差异有统计学意义（P＜0.05），对“疼痛环境”产生了厌恶反应，见表1、图2。空白对照组和足底注射NS组的回避分数比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而足底注射CFA组的回避分数明显大于其他两组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

表1 各组大鼠在“疼痛环境”匹配室前后停留时间的比较（±s）s

表1 各组大鼠在“疼痛环境”匹配室前后停留时间的比较（±s）s

*与Pre-conditioning比较，P＜0.05

组别 Pre-conditioning Post-conditioning空白对照组（n=6） 286.1±38.62 297.6±75.02足底皮下注射生理盐水组（n=7） 301.6±76.4 291.34±109.8足底注射CFA组（n=8） 304.1±39.8 156.5±80.2*

图2 各组大鼠在“疼痛环境”匹配室前后停留时间比较

图3 各组大鼠回避分数比较

3 讨论

随着现代临床医学的发展，人们越来越重视生存质量的提升。然而，各种疾病往往都伴随着疼痛的产生，目前疼痛已经成为继呼吸、脉搏、血压、体温4大生命体征之后的第5大生命体征。众所周知，疼痛包括对痛刺激的主观感觉和情绪体验。临床上的观察显示，疼痛的负性情绪给患者带来的痛苦远远大于痛刺激本身，因此，疼痛所带来的负性情绪的发生机制和缓解方法受到学者们的广泛关注[1-3]。例如，Rainville等[11]采用催眠暗示法发现，在痛刺激强度不变的情况下，随着受试者被暗示刺激强度升高，其不愉快程度也升高，与此同时前扣带皮层（anterior cingulated cortex，

ACC）的兴奋程度随之增强。2001年，Johansen等[4]指出吻侧ACC是与痛情绪高度相关的大脑皮层。也有研究表明，ACC内N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受体依赖的细胞外信号调节激酶-cAMP反应元件结合蛋白（extracellular signal regulated kinase-cAMP response element binding protein，ERK-CREB）信号通路参与了大鼠痛厌恶情绪的形成[5，12-14]。笔者实验室前期的研究表明，电针可以缓解疼痛中的情绪部分。

疼痛会引起情绪情感的反应过去早有发现，但苦于一直没有很好的动物模型进行更深入的研究。Johansen等[4]采用formalin诱导产生的条件化位置回避装置最早在啮齿类动物上分离出了行为意义上的痛情绪，为此类研究提供了新的方法和思路。该方法利用大鼠足底皮下注射formalin，诱导出F-CPA行为反应，说明formalin的刺激使大鼠记住了发生疼痛时的环境并因此而对“痛环境”产生了厌恶情绪。现有许多学者沿用或改进了这样的方法来研究痛情绪反应。张玉秋教授的实验室等根据Johansen等[4]的研究，结合实际情况复制出了福尔马林诱导的条件性位置回避模型，实验结果也比较稳定。福尔马林是甲醛的水溶液，诱导一个双时相的疼痛反应，第一时相（早时相）反应在注射后立即出现，持续数分钟，第二时相（晚时相）经过一个潜伏期，可持续数10 min左右[15]。同时根据相同的原理，也设计出了由激光诱导的条件性位置回避、由电击诱导的条件性位置回避模型和由高渗盐水诱导的条件性位置回避模型，都取得了不错的效果[16-17]。

笔者采用完全弗氏佐剂（CFA）来诱导产生类似的逃避行为，主要是因为CFA作为在疼痛研究中常被使用的炎性致痛物质，能在注射部位局部产生明显、持续时间较长的炎性反应，后者能引起大鼠痛敏，其高峰出现在注射后2～6 h，并持续约2周左右，将痛敏高峰与环境加以耦合，这样可以很好地模拟出炎性疼痛对环境产生的厌恶表现，即对痛环境的逃避[6-7]。根据上述的研究结果，笔者发现足底注射完全弗氏佐剂可以很好地产生条件性位置回避，而且与formalin或其他模型比较，缩短了实验周期，也便于实验者进行操作。这为利用动物模型对痛情绪展开更深入的研究提供了又一种简便、易行的新选择。

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Exploration of Pain Emotional Response Quantization Method

/ZHANG Xiao-yi，LAN Kun，FENG Xiaopu，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：045-048

Objective：To explore a new method for measuring pain mood：Complete Freund’s adjuvant（CFA）-induced CPA model to measure affective dimension of pain，based on the classical formalin of conditioned place avoidance （F-CPA） model and our laboratory conditions.Method：The male Sprague-Dawley （SD） rats’ left hind paw were given hypodermic injection the CFA，successfully established CFA induced CPA model in rat.Result：Compared with the injection of normal saline（NS） group and blank control group，intra-plantar injection of CFA induced persistence inflammatory pain and stabile CPA.Conclusion：CFA-induced CPA model in rat can be a method of reflecting painrelated negative emotion.

Complete Freund’s adjuvant； Conditioned place avoidance； Persistence inflammatory pain；Affective dimension of pain； Rat

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.015

2014-04-11） （本文编辑：欧丽）

国家自然科学基金资助项目（81371254）

①山西医科大学生理学系 山西 太原 030001

②山西医科大学医学影像系

③山西医科大学第一临床医学院

张策 张宇

First-author’s address：Department of Physiology in Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China