响应面法优化水溶性龙胆多糖的提取研究

王晨瑜，刘鑫，张晶，王战勇

（辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁抚顺113001）

响应面法优化水溶性龙胆多糖的提取研究

王晨瑜，刘鑫，张晶，王战勇*

（辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁抚顺113001）

采用响应面设计法（RSM）优化水溶性龙胆多糖的提取条件。在单因素试验基础上，结合响应面法优化确定提取水溶性龙胆多糖的最适工艺条件如下：提取温度100℃，料液比1∶26.56（g/mL），提取时间3 h，提取次数2次。此条件下，水溶性龙胆多糖的提取率预测值为13.51％，水溶性龙胆多糖的试验提取率为（13.36±0.25）％，预测值与验证值吻合较好。

多糖；优化；响应面法；龙胆多糖；水溶性

龙胆为龙胆科植物龙胆（Gentiana scabra Bunge）的干燥根和根茎。主要药效成分为龙胆苦苷、当归苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆多糖、龙胆碱等[1]。龙胆具有保肝、利胆、健胃、降压、抗炎、增强免疫功能、抗甲亢，抗过敏及对中枢神经系统的影响等药理作用[2]。龙胆多糖是龙胆的有效成分之一，具有重要的药理活性。现代药理学研究表明，龙胆多糖具有抗肿瘤[3]、降血脂[4]、抗凝血[5]、提高小鼠、雏鸡[6]等的免疫功能等多种药理作用。研究表明，龙胆中的多糖还有免疫调节、抗病毒、抗辐射、预防和治疗糖尿病、抗氧化[7-8]等生理功能，可作为药物用于临床治疗。

近些年，随着人们生活水平的不断提高，人们的健康保健意识在逐渐增强。多糖作为保健食品的主要成分己悄然兴起。我国的多糖资源丰富，尤其是来源于中草药的植物多糖，应用历史悠久，具有巨大的开发前景[9]。对多糖的构效和量效关系的研究，可促进以多糖（或复方多糖）为主要成份的高附加值的保健食品生产开发。本研究研究了水溶性龙胆多糖的提取，为其进一步的深入开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

龙胆（Gentiana scabra Bunge），产地为抚顺清原。苯酚购于北京鼎国生物技术有限责任公司；其余所有试剂均为国产分析纯。

1.2 设备

LD5-2A低速离心机：北京医用离心机厂；ALC-1100.2电子天平、ALC-210.4电子分析天平：德国赛多利斯股份公司；VIS-7220可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；A11basic分析研磨机：德国IKA公司。

1.3 方法

称取1 000 g干燥的龙胆，粉碎后用80％乙醇（体积分数）80℃回流脱脂6 h，去除有色物质、单糖、低聚糖和小分子物质，4 000 r/min离心20min，回收沉淀，60℃真空干燥后待用。准确称取龙胆样品预处理样品10 g，将样品与水按设定条件进行浸提后，4 000 r/min离心20min，收集浸提液。加3倍体积无水乙醇醇沉过夜后，4 000 r/min离心15min，收集沉淀，沉淀使用无水乙醇洗涤3次，无水乙醚洗1次，充分干燥后即得到龙胆粗多糖。样品可溶性总糖含量采用苯酚-硫酸法测定[10]。

1.4 响应面优化设计试验

结合单因素试验结果，采用中心复合设计三因素三水平的实验，以提取时间、提取温度、料液比为自变量，水溶性龙胆多糖产量为响应值，确定各因素水溶性龙胆多糖产量影响的显著性，并利用响应面法对水溶性龙胆多糖的提取条件进行优化。

2 结果与讨论

2.1 响应面分析试验对水溶性龙胆多糖提取条件的优化

综合单因素实验，采用Box–Behnken实验设计法，设计三因素三水平的响应面实验，以提取温度、提取时间、液料比、3个因素为自变量，以龙胆多糖提取率为响应值，所得到的数据列于表1。

表1 Box–Behnken设计方案（BBD）Table1 Experimental domain of Box–Behnken design（BBD）

根据对3个变量中心复合设计后所测得的水溶性龙胆多糖提取量结果如表2所示。

经过对实验数据的多元回归分析，响应变量和实验变量的关系如下列二元多次方程：

表2 BBD实验结果Table2 The results of response surface BBD

对方差进行分析，将拟合度和适合的模型总结于表3。

表3 方程拟合统计Table3 Fit statistics of Y

由表3可看出，决定系数（R2=0.980 4）表明了经过二次回归模型方差分析，只有1.96％的总差异不能由模型来解释。调整决定系数（调整R2=0.955 2）说明了该模型具有很高的显著性。与此同时，一个很低的变化系数值4.907清楚的显示出很高的精密度等级和实验值很高的可靠性。此外，该模型的实验值在预期的实验变量的范围内。进一步说明了回归方程的拟合程度较好。

上述回归得到的二元多次方程的回归系数被列于表4。

P值是将观察结果认为有效即具有总体代表性的犯错概率，越小的P值匹配的系数就越可靠。表4可以看出一次系数（X2，X3），二次系数（X32）具有统计学意义，它具有较小的P值（P＜0.05）。可看出，提取时间、料液比对多糖提取率的影响最为显著。

表4 预期二次多项式模型的变化系数Table4 Regression coefficients of the predicted quadratic polynomial model

根据回归分析结果做出相应的响应等高面图和曲面图，以确认提取温度（X1）、提取时间（X2）、料液比（X3）3因素对多糖提取率的影响，以此来推测出自变量和因变量的关系。结果见图1，图2和图3。

图1 温度和时间对多糖产率影响的响应面等高线图和3D图Fig.1 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction temperature and time on the yield of polysaccharide

由图1可看出，当其中当料液比一定时，提取时间保持不变，随温度的升高，龙胆多糖产率增加，且在高温中要比在低温中升高的速度快；温度不变，随提取时间的延长，龙胆多糖产率缓慢上升至稳定。由此可以推断出，在料液比一定的条件下，高温、延时有助于提高多糖产率。

图2 时间和料液比及其相互作用对多糖产率影响的响应面等高线图和3D图Fig.2 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction time and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

图3 温度和料液比及其相互作用对多糖产率影响的响应面等高线图和3D图Fig.3 Three-dimensional response surface graph and contour plots response surface graph of extraction temperature and the solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

由图2可以看出，当提取温度一定时，保持时间不变而增加料液比值，龙胆多糖的提取率缓慢上升直到稳定；保持料液比不变而延长浸提时间，龙胆多糖的提取率逐渐增加。由此表明，在提取温度一定的情况下，提高料液比和延长提取时间有利于提高多糖的提取率。

由图3可以看出，在提取时间不变的条件下，龙胆多糖产率随温度和料液比的增加而增加。

根据所得回归模型，可预测最佳工艺为提取温度为100℃、提取时间为3 h、料液比为1∶26.56（g/mL），此时多糖提取率理论上可达13.51％。为了检验试验结果是否与真实情况一致，根据以上试验结果进行了近似验证试验，进行3次平行试验，以验证实验检测值与理论预测值是否相符，进行可靠分析，得到最后优化方案。结果水溶性龙胆多糖实际提取率为（13.36± 0.25）％，理论预测值相比理论值误差较小，可见该模型能较好地模拟和预测试验产率。

3 结论

本研究采用响应面法优化龙胆多糖提取工艺参数，得出最佳提取条件为：提取次数为2次，提取温度为100℃，提取时间为3 h，料液比为1∶26.56（g/mL）。此条件下，水溶性龙胆多糖的提取率预测值为13.51％，水溶性龙胆多糖的实验提取率为（13.36±0.25）％，在这个条件下与预期值十分接近，说明模型比较可靠。为下一步的大规模提取龙胆多提供了参考。

[1]王德,郎永生,刘娟.龙胆药效成分含量积累规律研究进展[J].黑龙江医药,2011,24(2):252-253

[2]刘涛,才谦,付玉芹,等.中药龙胆的研究进展[J].辽宁中医杂志, 2004,31(1):85-86

[3]江蔚新,江培,张晓燕,等.龙胆多糖的体内抗肿瘤作用研究[J].中成药,2008,30(10):1530-1532

[4]江蔚新,何文顺,赵玺.龙胆多糖的降血脂作用的研究[J].黑龙江医药,2008,21(4):31-33

[5]江蔚新,赵玺.龙胆多糖的抗凝血作用的研究[J].黑龙江医药,2008, 21(5):31-32

[6]孟博,王臣,赵蔓,等.龙胆多糖对雏鸡免疫功能的影响[J].中国农村小康科技,2010(4):57-58

[7]王赫.龙胆多糖提取分离纯化及其组成糖分析[J].中国医药指南, 2011(21):250-251

[8]KIM G Y,PARK SK,LEE M K,et al.Proteoglycan isolated from Phellinus linteus activates murine B lymphocytes via protein kinase C and protein tyrosinkinase[J].Int Immunopharmacol,2003,3(9): 1281-1292

[9]张媛,刘健.植物多糖生物活性的研究进展[J].天津药学,2010,22 (2):62-64

[10]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,2003: 11-12

Optimization of Extraction of Water-solubility Polysaccharide from Gentiana scabra Bunge by Response Surface Methodology

WANG Chen-yu，LIU Xin，ZHANG Jing，WANG Zhan-yong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Environmental Engineering，Liaoning Shihua University，Fushun 113001，Liaoning，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the extraction conditions of watersolubility polysaccharides from the Gentiana scabra Bunge（GSP）.Combining single factor test and response surface methodology，the optimum extraction conditions were chosen as follows：extraction temperature was 100℃，ratio of water to raw material was 26.56，extraction time was 3 h，and number of extraction was 2.Under the optimize conditions，the predicted value of yield of GSP was 13.51％，and the experimental yield of GSP was（13.36± 0.25）％，which showed the results were reasonable.

polysaccharides；optimization；response surface methodology；Gentiana scabra Bunge；watersolubility

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.009

2012-12-03

王晨瑜（1986—），女（汉），在读硕士，研究方向：生物化工。

*通信作者