酶催化酸解棉籽油分提产物合成结构脂质研究

2014-03-13 08:54李宗军侯爱香
中国粮油学报 2014年11期
关键词:辛酸脂肪酶底物

黄 璜 李宗军 侯爱香

(湖南农业大学食品科学技术学院1,长沙 410128)

(食品科学与生物技术湖南省重点实验室2,长沙 410128)

脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)是一类特殊的酯酶,能水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油,其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯,特点是在油水界面起催化作用。在粮油食品工业中,脂肪酶可催化酯交换、水解、醇解等反应,利用Sn1,3-位定向脂肪酶催化油脂进行定向酯交换,将廉价的油脂通过改性生产高利用价值的油脂,目前国内外研究最多的是生产类可可脂、人造黄油、起酥油等。在功能性结构脂质工业方面,利用酶法将具有不同营养和生理功能的脂肪酸结合到甘油骨架的特殊位置,形成特定分子结构的三酰基甘油酯是目前国内外研究热点。

我国是世界上最大的棉籽油加工国,据统计,近几年我国的棉籽压榨量在1 000万t左右,在国产油料作物中,棉籽压榨量仅次于油菜籽和花生,位居第3位,棉籽油是一种重要的食用植物油。棉籽油中含有大量的人体必需脂肪酸,最宜与动物脂肪混合食用,其不饱和脂肪酸油酸和亚油酸质量分数占70%~80%,其中含量最多的多不饱和脂肪酸亚油酸占46%~60%,能有效抑制血液中胆固醇上升,维护人体的健康。棉籽油最大的缺点是脂肪酸凝固点较高,低温贮存时会有高熔点的固体酯从油中析出,造成流动性差,不易储藏,从而影响了外观和食用性能。

棉籽油分提产物,是棉籽油在冬化即结晶分提工艺中,油在低温下养晶一段时间之后过滤,油通过帆布包裹的板式过滤机或箱式过滤机,剩余的低温下引起油变浑浊且黏稠的高熔点的固体脂肪。这些固脂既可以是少量的高熔点甘油酯也可以是蜡质,占棉籽油量的20%~25%。

由于目前国内棉籽产业链较短,绝大部分企业没有对副产品进行深加工就直接投入需求使用。以致造成棉籽油分提产物的浪费,本试验以棉籽油分提产物和中碳链脂肪酸(辛酸)为底物,采用Sn1,3-位定向的固定化脂肪酶作为催化剂,进行酶催化酸解反应,制备富含亚油酸和辛酸的结构脂质,合成的结构脂质产物中辛酸主要位于甘油Sn-1,3位,而亚油酸、油酸主要位于甘油骨架Sn-2位。该结构脂质在保留传统棉籽油的物理特性和使用功能基础上,降低了高熔点的甘油酯含量,改善了棉籽油分提产物的脂肪酸组成,增加了具有一定功能的中碳链脂肪酸辛酸,又不破坏原有的不饱和脂肪酸亚油酸和油酸的含量,而且最大限度的发挥了亚油酸和油酸的功效,添加的辛酸又具有热量低、功能速度快、降血脂、和减少脂肪在体力堆积的功效,且充分利用了棉籽油分提产物,使其变废为宝,扩大了油脂用途,提高棉籽油的使用价值和经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棉籽油分提产物:湖南盈成油脂工业有限公司辛酸(分析纯99%):国药集团化学试剂有限公司;固定化脂肪酶 Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozyme 435:诺维信生物技术有限公司。

GC-4000A气相色谱仪:北京东西分析仪器有限公司;SHZ-C水浴恒温振荡器:上海浦东物理光学仪器厂;TDL80-2B台式离心机:上海安亭科学仪器厂;SHZ-(111)循环水真空泵:天津华鑫仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 酶促酸解反应

称取2 g棉籽油分提产物于50 mL具塞三角瓶中,按照一定底物比(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比)加入辛酸,加入固定化脂肪酶(底物量计),混匀,盖紧塞子,置于水浴恒温振荡器中,设置一定反应温度,调整振荡速率为100 r/min,反应一定时间,终止反应,得到混合产物。

1.2.2 产物分离纯化

将上述混合产物于离心机中离心去除脂肪酶,取上层液溶于15 mL正己烷中,滴2~3滴酚酞指示剂,用1 mol/L碱滴定至微红,剧烈摇晃,静置分离出正己烷层,并于水相中加入10 mL正己烷再次萃取,合并正己烷层,于旋转蒸发仪中70℃真空旋转蒸发,得到结构脂质。

1.2.3 脂肪酶稳定性研究

将每次反应的固定化脂肪酶,通过过滤将酶与产物分离并回收,用石油醚(沸程30~60℃)洗涤2次,室温下吹干,然后进行循环使用,以考察脂肪酶的稳定性。

1.2.4 结构脂质分析

取50 mg结构脂质于10 mL容量瓶中,加入2 mL石油醚∶苯(1∶1),待油脂完全溶解后加入1 mL KOH-甲醇溶液,剧烈振荡1 min,并常温下放置30 min,使充分甲酯化,用蒸馏水定容,静置分层,取上层清液10 uL于气相色谱中测定脂肪酸组成及含量。

2 结果与讨论

2.1 酰基供体选择

中链脂肪酸酯(MCT)即含有中链脂肪酸(MCFA)的脂质在胃肠中水解速度快,可直接从门静脉吸收,且不需要肉碱就能直接进入线粒体氧化分解,因此具有代谢易、功能快、热值低,同时还有氧化稳定性强、熔点低、改善人体代谢条件等特殊功能,还对某些疾病有一定的治疗作用。目前国内外研究较多的MCFA有八碳和十碳脂肪酸——辛酸和癸酸,本试验选用辛酸作为酰基供体。

2.2 脱酸碱液选择

脂肪酶作用于三酰甘油,使Sn1,3-位长链脂肪酸断裂,游离于油相中,加之底物中含有过量的辛酸,使得离心去酶后的混合产物中游离脂肪酸含量较高,为了脱去游离脂肪酸,防止油酸败,工业中常用碱液中和脱酸,产生的游离脂肪酸盐与油脂分层后去除,得到结构脂质。万银松[1]在对菜籽油进行酶催化制取结构脂质研究中使用0.96 mol/L的KOH溶液滴定中和游离脂肪酸。王瑛瑶等[2]在对菜籽油酶催化改性反应体系中使用8 mol/L的KOH-乙醇水溶液(30∶70)中和游离脂肪酸。工业生产中常用一定浓度的NaOH进行碱炼脱酸。本试验分别对1 mol/L的 KOH水溶液、KOH-乙醇水溶液、NaOH-乙醇水溶液(V乙醇∶V水=30∶70,乙醇为99.5%分析纯)3种碱液中和游离脂肪酸的能力进行了比较。结果见表1。

表1 3种不同碱液中和游离脂肪酸能力的比较

由表1可看出,KOH-乙醇水溶液进行滴定分层时间最快,且为液液分层,容易分离出上层油脂。原因在于:1)KOH相比NaOH碱性强,与酸中和速度快且分层明显;2)NaOH具有很强的吸水性和潮解性,放置一定时间后有少量的白色物析出,工业中常用NaOH是因为其价格低廉,经济实惠;3)乙醇是一种很好的溶剂,在油脂的相关反应中,加入乙醇既能溶解KOH,又能溶解油脂,让它们在均相中充分接触,增大接触面积,加快反应速率,提高反应效率,用乙醇水溶液滴定中和后,上层正己烷层与下层脂肪酸盐层分离快且明显。因此,比较3种碱液,KOH-乙醇水溶液脱酸效果最好。

2.3 脂肪酶筛选

不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性,如催化活力、作用三酰甘油位置专一性、酶稳定性等。在酶催化油脂改性反应体系中,脂肪酶对产物的合成率、脂肪酸在三酰甘油中的分布情况起着决定性作用[3]。为了得到最佳的结构脂质,筛选最适合棉籽油分提产物酶法改性的脂肪酶,对棉籽油分提产物三酰甘油Sn1,3-位作用特异性最强的脂肪酶,本试验选用了3种脂肪酶,对其催化特异性及催化效果进行研究对比。

2.3.1 不同酶添加量下3种脂肪酶催化能力比较

取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM,Lipozyme TL IM,Novozyme 435这3种脂肪酶添加量2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%,于水浴恒温振荡器中,反应温度60℃,振荡速率为100 r/min,反应时间4 h。得到不同酶添加量下3种脂肪酶催化制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图1所示。

图1 不同酶添加量下3种脂肪酶催化能力比较

由图1可以看出,3种脂肪酶都能催化底物酸解反应,但是效果差别较显著,随着酶添加量的增多,辛酸含量不断增加,且当酶添加量达到10%时,辛酸含量几乎没有变化。3种脂肪酶相比较,Lipozyme RM IM脂肪酶催化效果最好(辛酸质量分数最高达25.62%),明显高于另外2种脂肪酶,其次是Novozyme 435脂肪酶(辛酸质量分数最高达9.98%),催化效果最差的是Lipozyme TL IM脂肪酶(辛酸质量分数最高仅为2.58%),Lipozyme TL IM脂肪酶添加量2%和4%时对底物几乎没有催化能力,可能是60℃下Lipozyme TL IM脂肪酶活性受影响。总之,在不同酶添加量条件下,3种脂肪酶中,Lipozyme RM IM脂肪酶催化棉籽油分提产物制取的结构脂质中辛酸含量最高。

2.3.2 不同温度下3种脂肪酶催化能力比较

取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM,Lipozyme TL IM,Novozyme 435这3种脂肪酶添加量8%,于水浴恒温振荡器中,分别设反应温度为40、50、60、70、80℃,振荡速率为 100 r/min,反应时间4 h。得到不同反应温度下3种脂肪酶催化制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图2所示。

图2 不同反应温度下3种脂肪酶催化能力比较

由图2可看出,在不同温度条件下,Lipozyme RM IM和Novozyme 435脂肪酶都能较好的催化底物的酸解反应,而Lipozyme TL IM脂肪酶则催化活性很低。不同的反应温度下3种脂肪酶的催化活性的变化趋势不同,Lipozyme RM IM催化活性随着温度升高而加强,到60℃时催化活性达到最大,随后活性逐渐减弱。Novozyme 435催化活性50℃之前变化不大,50℃之后随着温度升高,催化活性不断增强。Lipozyme TL IM催化活性很低,但也存在变化趋势,随着温度的升高,其催化活性不断减弱。总之,3种脂肪酶相比,Lipozyme RM IM在不同反应温度下催化活性最强。

基于2个条件下3种脂肪酶催化能力的比较,Lipozyme RM IM脂肪酶催化棉籽油分提产物形成的结构脂质中辛酸的含量最高。因此选用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM作为催化剂进行进一步研究。

2.4 溶剂体系选择

脂肪酶在油脂改性中所应用的反应体系主要有4类,分别为有机相中的酶催化反应、微水条件下的无溶剂体系、微乳液体系和炒临界流体[4]。目前在有关结构脂质制取的文献报道中,应用最多的是无溶剂体系和含微量水分的有机溶剂体系。本试验采用2种最常用的反应体系——无溶剂体系和正己烷体系,比较2种体系下脂肪酶的催化能力。取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),加入10 mL正己烷,Lipozyme RM IM脂肪酶添加量 2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%,于水浴恒温振荡器中,反应温度60℃,振荡速率为100 r/min,反应时间4 h。不添加正己烷重复上述试验。得到不同反应体系下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图3所示。

图3 2种溶剂体系下脂肪酶催化能力比较

由图3可以看出,2种反应体系下,随着酶添加量的增多,辛酸含量呈上升趋势,当酶量达到10%时,随着酶量继续加大,辛酸含量变化不明显。在酶添加量为2%时,两体系中辛酸质量分数相差10%,随着酶量的加大,两体系中辛酸含量逐渐接近,当达到12%时相差仅为2%,差别并不大。因此,虽然正己烷体系下酶催化能力略高于无溶剂体系,但由于正己烷的有毒性、易燃性等性质,和有机溶剂使用引起生产成本的增加使得有机溶剂不建议使用于食用油生产当中,且由图3看出无溶剂体系下脂肪酶的催化效果也很明显。

无溶剂体系中,脂肪酶直接作用于反应底物,具有较多优点:提高了反应底物浓度和产物浓度;反应速度快;产物得率高;反应体积小;减少了产物分离提纯的步骤,使更容易纯化;因不用或用少量的有机溶剂而大大降低了对环境的污染,降低了回收有机溶剂的成本,减少了溶剂残留对人体造成的影响;为反应提供了与传统溶剂不同的新的分子环境,有可能使反应的选择性、转化率得到提高[5]。因此,无溶剂体系是个极具潜力的反应技术,本试验采用无溶剂体系进行进一步研究。

2.5 影响辛酸合成率的单因素试验

2.5.1 反应温度对辛酸合成率的影响

Xu等[6-7]的研究表明,在 Lipozyme RM IM催化菜籽油与辛酸合成结构脂质反应体系中,随着反应温度升高,酯交换程度和反应速度均提高,同时还可使酰基位移反应的程度和速度都随之增加,在50~70℃内酰基发生位移呈直线增加趋势。本试验取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应时间4 h,反应温度分别为40、50、60、70、80℃。得到不同反应温度下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图4所示。

图4 反应温度对辛酸合成率的影响

由图4可以看出,随着反应温度的增加,结构脂质的辛酸含量不断上升,在60℃时辛酸质量分数达到最高,为22.45%。当反应温度超过60℃时,辛酸含量有所下降,可能是因为过高的温度导致脂肪酶酶活性下降,从而影响辛酸的合成。因此,在本试验初步确定最适宜的反应温度为60℃。

2.5.2 反应时间对辛酸合成率的影响

取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应温度 60℃,反应时间分别为 2、4、6、8、10 h,得到不同反应时间下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图5所示。

图5 反应时间对辛酸合成率的影响

由图5可以看出,随着反应时间的延长,制取结构脂质中辛酸含量逐渐增大,脂肪酶与底物接触得越充分,当反应时间达到6 h时,辛酸质量分数达到最大,为30.97%,当反应时间大于6 h,辛酸含量开始不断降低。时间延长将导致各种程度酰基位移的发生,导致大量副产物的生成,因而对目标产物中辛酸合成造成很大影响[8]。因此,本试验初步确定最适宜的反应时间为6 h。

2.5.3 酶添加量对辛酸合成率的影响

取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例2∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM脂肪酶添加量分别为 2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应温度60℃,反应时间为4 h,得到不同酶添加量下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图6所示。

图6 酶添加量对辛酸合成率的影响

由图6可以看出,随着脂肪酶添加量的增多,结构脂质中辛酸含量逐渐增加,酶量为2%~10%时,辛酸质量分数增加明显,从10.88%上升到23.77%,提高了13%。当酶添加量超过10%时,辛酸含量变化不明显,可能是因为,酶量的增加可以提高酶的催化效果,但过高的酶量会使体系内参与反应的水分减少,底物浓度加大导致无溶剂体系中黏度增大,传质阻力增大,使得酶催化效率降低。因此,本试验初步确定最适宜的脂肪酶添加量为10%。

2.5.4 底物比对辛酸合成率的影响

取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比)分别为 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1,Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应温度60℃,反应时间为4 h,得到不同底物比例下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图7所示。

图7 底物比对辛酸合成率的影响

由图7可以看出,当底物比例为1∶1时,辛酸质量分数15.69%,当比例升高到2∶1时,辛酸质量分数骤然升高,达到22.45%,但随着底物比例的继续增大,辛酸含量不但没有继续升高,反而呈现下降趋势,当底物比例达到4∶1时,辛酸质量分数下降到最低,为13.3%,之后随着底物比例加大,辛酸含量达到动态平衡,不再变化。可能是因为,在无溶剂体系下脂肪酶直接作用于底物,高浓度的辛酸对酶催化环境的改变比较明显,体系中高浓度的游离酸使酶分子周围水相酸化及其在水相中溶解度增大,高浓度游离酸可以产生大量游离或离子化羧基,造成酶分子周围水相的酸化,使酶催化微环境或酶的空间构象发生改变[9],也可能是由于过多的底物导致了酶被底物包裹,因而影响了催化效率[10]。因此,本试验初步确定最适宜底物比例为2∶1。

2.5.5 酶稳定性研究

固定化酶不仅有稳定性高、易于反应物分离等优点,还可以进行回收反复使用,既可以使生产连续化,同时也降低了生产成本。但一般使用次数越多可使酶的催化活性减弱。本试验对脂肪酶的稳定性进行研究,取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比)3∶1,Lipozyme RM IM脂肪酶添加量10%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应温度70℃,反应时间分别为8 h,得到循环使用脂肪酶不同次数下辛酸含量的变化如图8所示。

图8 酶重复使用次数对辛酸合成率的影响

由图8可知,本试验条件下Lipozyme RM IM脂肪酶具有良好的稳定性,循环使用10次,辛酸含量几乎没有变化,到第11次时辛酸含量开始下降,但此时的辛酸质量分数仍然达到了30%以上。因此,脂肪酶Lipozyme RM IM适合于工业化生产结构脂质。

2.6 响应面试验安排及试验结果

在单因素试验基础上,由Design-Expert.8.05b软件的中心组合设计原理,以辛酸含量为响应值,对相关性较大的反应温度(A)、反应时间(B)、酶添加量(C)、底物比例(辛酸/棉籽油分提产物摩尔比)4个因素进行优化设计,建立二次多项式回归模型,综合考虑各个因素对结构脂质中辛酸含量的影响,因素水平编码见表2,中心组合试验设计与结果见表3。

表2 因素水平编码

表3 试验安排及结果

2.6.1 各参数对辛酸含量的响应面结果分析

对表3所得的数据,采用响应面Design-Expert.8.05b软件统计分析方法对数据进行拟合,建立二次响应面回归模型如下:

辛酸质量分数 =26.11+1.11A+1.99B-0.19C+4.50D-0.12AB+2.08AC-0.93AD+0.18BC+0.93BD+2.34CD-0.084A2-0.65B2+1.12C2-1.66D2,R2=0.955 8。

回归分析与方差分析结果见表4。

表4 回归分析与方差分析结果

方差分析结果表明,该模型回归显著(P<0.01),表明回归模型与试验结果较吻合。失拟项不显著(P=0.086 0>0.05),表明该模型拟合程度良好,试验误差小。方程决定系数R2=0.955 8,说明95.6%的试验数据可用这个方程解释,也可用该模型来分析和预测试验结果。变异系数(Coefficient of Variability,CV)代表不同试验组之间的变异程度,本试验的CV值为4.91%,较低的CV值说明本试验的重复性比较好。由F检验结果的显著性分析可知,影响最显著地因素是B和D,即反应时间和底物比例,其他2个因素影响较小,因素贡献率为B=D>A>C,即反应时间 =底物比例 >反应温度 >酶添加量。

应用响应面优化分析方法分析回归模型得到最优的响应结果为:反应温度68℃,反应时间7.88 h,酶添加量11.8%,底物比例2.98∶1,此时响应面有最优值辛酸质量分数达35.25%。

对响应面得出的最优条件进行验证试验,制备结构脂质工艺条件为:反应温度68℃,反应时间8 h,酶添加量12%,底物比例3∶1,得到结构脂质辛酸质量分数为33.63%,与理论预测值基本一致,相对误差为1.62%。说明回归方程与实际操作拟合性好,验证了模型是有意义的。

2.6.2 含水量对辛酸合成率的影响

所谓的无溶剂体系并不是绝对无水,一般含水量在0.01%以下,在绝对无水的条件下酶促反应是不可能发生的。水分是酶维持活性构象所必需,酶的活性构象形成依赖于各种氢键、疏水键等非共价键的相互作用,而水参与氢键形成和疏水的相互作用。但水分过多容易使酶积聚成团,导致疏水性底物较难与酶的活性部位接触,从而影响传质。对不同的脂肪酶及不同的反应体系,其最佳的含水量也是不同的。本试验根据响应面得出的最优工艺条件,即取2 g棉籽油分提产物,辛酸比例3∶1(辛酸/棉籽油分提产物,物质的量比),Lipozyme RM IM脂肪酶添加量12%,于水浴恒温振荡器中,振荡速率为100 r/min,反应温度分别为68℃,反应时间10 h,得到不同含水量下制取的结构脂质中辛酸含量变化曲线如图9所示。

图9 含水量对辛酸合成率的影响

图9可知,在所选含水量范围内,辛酸含量变化复杂,总体看来辛酸含量呈下降趋势,但总的改变量并不大,虽然含水量10%时辛酸含量略有上升,但过多的含水量会使反应向水解方向转变,影响目标物的生成。因此,本研究中原始底物的含水量足以维持酶的催化活性,且辛酸含量很高,所以不再考虑额外添加水分。

3 结论

对脂肪酶催化棉籽油分提产物和辛酸酸解反应制取结构脂质进行了研究。脱酸碱液选择表明,KOH-乙醇水(V乙醇∶V水=30∶70)溶液脱酸效果最好;脂肪酶筛选表明,Lipozyme RM IM具有较好的催化活性;溶剂体系选择表明,无溶剂体系更适合制取结构脂质;利用响应面分析方法进行优化试验,建立了相应的回归模型,得到最优酶法酸解工艺条件为:反应温度68℃,反应时间7.88 h,酶添加量11.8%,底物比例2.98∶1,此时响应面有最优值辛酸质量分数达35.25%。在实际操作中对此工艺条件进行验证试验,得到结构脂质中辛酸质量分数为33.63%,与理论预测值一致。底物本身的含水量足以维持酶的催化活性。棉籽油分提产物进行油脂改性后制取的结构脂质,产品为淡黄色油状液体,具有棉籽油固有香味,具有良好的物理性能,脂肪酸组成更有利于人体健康。

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