猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒混合感染的多重PCR诊断

王伟丞，曾智勇,2*，汤德元，刘 钊（.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型(PCV2)感染是世界范围内一种重要的猪传染病，该病于1991年在加拿大首次被发现，目前已呈世界性流行。我国许多地方都报道有该病的流行，且常与其他病毒混合感染，给养猪业带来了巨大的损失[1]。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸系统障碍为特征的传染病[2]，1996年首次证实我国存在PRRS，至今已流行于我国大部分地区，且常呈暴发式流行。特别是2006年发生的“猪高热病”，据相关研究表明，PRRSV的NSP2基因发生部分缺失，致病性增强，高致病性猪蓝耳病给养猪业的发展带来了重创[3]。猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒引起的一种高致死性烈性传染病，我国虽然有免疫效果较好的猪瘟兔化弱毒疫苗，但是免疫失败的事例时有发生，其原因可能是目前流行的猪瘟病毒发生变异导致与猪瘟疫苗毒株抗原性不一致，使得疫苗的保护力降低[4]。2013年8月，安顺地区某猪场发生一起以仔猪腹泻、保育猪呼吸困难、母猪流产为特征的疾病，使用抗生素无效，发病率和死亡率较高。该猪场于2013年9月送检1头病死仔猪以确诊病毒感染情况，本试验选用猪繁殖障碍性病毒性疫病6重PCR检测方法[5]，对该病料进行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV感染情况的快速诊断。现将诊断过程报道如下：

1 材料与方法

1.1 病料

贵州省安顺市某猪场送检1头60日龄病猪。

1.2 参考序列与主要试剂

根据美国国立生物技术信息中心（NCBI） 公 布PRVgE（NC-006151）、PPVNS1（NC-001718）、P C V 2O R F 2(N C-0 0 5 1 4 8）、PRR SVOR F 5(N C-001961)、CSFVE2（X 87939）、JEVE(M 55506)序列设计多重PCR引物；核酸提取试 剂 盒；Prim eScriptOneStepRTPCRK itVer.2.0。

图1 病料多重PCR扩增产物电泳结果

1.3 引物的设计与合成

设计了检测PRV、PPV、PCV 2、PRRSV、CSFV和JEV的6对引物，预期的扩增目的片段长度为178bp、271bp、353bp、433bp、508bp和1015bp。引物送上海生物工程有限公司合成。

1.4 病料处理

采集送检病猪肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结等组织置于乳钵剪碎后用PBS按1∶5倍稀释研磨，制成乳悬液，-80℃反复冻融3次，8000r/m in离心15m in，取上清于-20℃保存备用。

1.5 病料中DNA/RNA的抽提

严格按宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）核酸提取试剂盒说明书提取病料中的核酸。

1.6 多重PCR反应

以病料核酸为模版进行多重PCR扩 增。 反 应 体 系 为50µL，2×oneStepBu ffer25µL， 核 酸模 版5µL，Prim eScrip toneStepEnzymeM ix2µL，上下游引物各1µL， 共 6对 引 物，RNaseFreeH2O6µL。反应条件：50℃40m in；94℃5m in；94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10m in。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 流行特点和临诊症状

贵州省安顺市某猪场存栏猪1500头左右，其中母猪130头。2013年8月该猪场突然出现以妊娠母猪流产、早产、产死胎，育肥猪进行性消瘦、呼吸困难和仔猪高死亡率为特征的疾病，发病率在50%左右，仔猪病死率高达80%。发病后曾用强力霉素治疗，效果不佳，该猪场已免疫猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征疫苗，未免疫猪圆环病毒疫苗。

2.2 解剖病理变化

剖检可见病猪全身淋巴结肿大出血，特别是腹股沟淋巴结，呈红黑色外观；肾脏有针尖状出血点且色泽变淡；脾脏肿大呈紫黑色；肺呈弥漫性间质性肺炎，其他病变不明显。

2.3 PCR扩增结果

应用已建立的6重PCR检测技术，对送检病料进行快速检测，扩增出了353bp、433bp和508bp左右大小的特异性条带，结果表明，该病死仔猪感染有PCV2、PRRSV和CSFV。（图1）

3 讨论

从发病情况、临床症状、剖检变化及实验室诊断，确诊该猪场感染有PCV2、PRRSV和CSFV。

该场尽管免疫了PRRSV和CSFV疫苗，但送检仔猪仍出现PCV2、PRRSV和CSFV的三重感染，笔者认为可能系该猪场因未免疫PCV2疫苗，导致仔猪群感染PCV2野毒。由于PCV 2具有免疫抑制作用，会造成猪免疫系统损伤，导致PRRSV和CSFV疫苗免疫效果不佳，甚至免疫失败，进而因多重感染导致仔猪的大量死亡。单一的PCV2或PRRSV感染对猪机体的毒力较弱，但当它们发生混合感染或与其他病原混合感染时会导致死亡率升高，危害较大[6]。2010年，潘艳[7]报道，在PCV2阳性猪场，接种CSFV疫苗后，大大降低该疫苗的效果，甚至导致无抗体产生，容易引发CSFV的暴发，所以在养猪生产中，一定要对PCV2进行检测，确诊PCV2阳性的猪场，要对CSFV疫苗免疫猪进行其抗体的动态监测，不能因接种CSFV疫苗就忽视对猪瘟的防疫。

由于猪群中PCV2感染较为普遍，但真正发病的或表现出临床症状的较少，加之PCV 2商品化疫苗的价格较高，因此很多养殖户对PCV2的疫苗免疫不够重视，从而导致猪群容易免疫抑制。应用PCV2疫苗免疫是预防该病毒感染的主要手段之一，刘长明[8]研究表明，疫苗接种猪群与空白对照组对比，主动免疫仔猪发病率可下降15.1%，死淘率可下降3.6%；免疫母猪后结果显示，仔猪获得被动免疫出生时死胎率下降了2.3%，初生仔猪成活率提高了7.6%，断奶时成活率提高了7.5%，且猪群药物保健费用明显下降、饲料转化率提高。因此猪场对于PCV2感染的防控，接种PCV2疫苗是非常重要的。

本试验从1头仔猪病料中同时检测出PCV2、PRRSV和CSFV，可知现在的猪场感染越来越复杂，由此给疾病的诊断和防控工作带来新的挑战，在诊断和预防上都应综合考虑，特建议猪场在进行疫苗免疫前后，均须对相关疫病抗体进行检测，以确定野毒感染情况及疫苗免疫效果，及时调整免疫程序。

[1]郎洪武，陈晓春，吴华伟，等.猪圆环病毒病及其生物制品学的研究进展[J].中国兽医科学,2012(5):545-550.

[2]代军，任志华，邓俊良，等.猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2013(7):28-31.

[3]吴锦艳，田宏，尚佑军，等.高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析[J].畜牧兽医学报,2009，40(3):438-443.

[4]郝飞，汤德元，曾智勇，等.我国猪瘟病毒基因流行变异研究[J].中国猪业,2013(2):42-44.

[5]刘志杰，曾智勇，汤德元，等.猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用[J].畜牧兽医学报,2012(9):1429-1436.

[6]温永俊，吴国军，蔡雪辉，等.猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染对仔猪致病性的评估[J].中国预防兽医学报,2007(5):336-340.

[7]潘艳，李军，禤雄标，等.猪瘟疫苗在猪圆环病毒2型阳性猪场的免疫效果观察[J].动物医学进展,2010,31(11):23-26.

[8]刘长明，危艳武，陆月华，等.猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)的研制与应用[J].畜牧兽医科技信息,2010(9):29-30.