赵紫微,潘道东,曾小群,王淑慧
(宁波大学海洋学院,浙江宁波315211)
乳清蛋白主要存在于工业生产干酪的副产品-乳清中,它是一种高营养的优质蛋白[1]。但是根据一些统计数据,每年大约有40%~50%的乳清被浪费;在这些乳清被浪费同时,大量的乳清蛋白也被浪费;因此对乳清蛋白的综合利用也备受关注[2]。乳清蛋白不但含有许多生物活性物质,而且具备很高的代谢率,容易被消化;因而具有很高的生物利用价值和功能特性。
乳清蛋白溶液具备良好功能特性,比如胶凝性、溶解性等,所以它可以作为一种食品组分来赋予食品一些特殊的感官性质[3-5]。特别是近年来随着消费者对低脂食品需求的升高,对脂肪替代品的开发和研究已经逐渐地引起了相关工作人员的重视,部分学者开始利用酶改性乳清蛋白来研究和开发脂肪替代品[6-8]。这其中采用最多的是利用地衣芽孢杆菌蛋白酶(BLP)和碱性蛋白酶(Alcalase2.4L)来诱导的蛋白质凝胶,但是目前关于酶诱导蛋白质凝胶的影响因素方面的研究报道相对较少。
本实验选用中性蛋白酶对乳清蛋白进行水解,在适当条件下制备质构特性类似脂肪的凝胶。先在单因素实验的基础上研究了不同的参数如pH、温度、酶与底物比、黄原胶对凝胶性质影响,然后进行了Box-Behnken实验并利用模糊数学结合响应曲面法优化了诱导条件。对酶诱导蛋白质成胶的一些相关因素进行了研究和探讨,为低脂食品的研究和开发提供了借鉴。
乳清蛋白粉 宁波大学曹光彪科技楼127实验室提供;中性蛋白酶 酶活力为100000U/g,宁夏夏盛实业集团有限公司;氯化钙、黄原胶 国药生物科技有限公司;参考奶油 市售;其余化学分析试剂 均为分析纯。
PL403电子天平、FE-20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;DK-20电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;TA.XT.plus质构分析仪StableMicro System公司;NICOMP 380/ZLS纳米粒度分析仪 美国PSS公司。
1.2.1 凝胶制备工艺参数的单因素实验 为了探究各个工艺参数对所制备凝胶的性质影响,并为响应曲面优化实验的各因素与水平的选择提供依据[9]。分别选取体系pH、凝胶温度、黄原胶添加量、酶与底物浓度比等4个因素进行单因素实验。具体为:体系pH:考察体系pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时的凝胶效果;凝胶温度:考察凝胶温度分别为35、40、45、50、55℃时的凝胶效果;黄原胶添加量:考察黄原胶添加量为0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%时凝胶效果;酶与底物浓度比:分别观察酶与底物浓度比为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%时的凝胶效果;在考察单因素时,其他各因素的水平分别设定为:乳清蛋白质量浓度1g/10mL、氯化钙添加量2mmol/L、反应pH7.0、反应温度45℃、黄原胶添加量0.01%、酶与底物浓度比0.75%。
1.2.2 凝胶的质构分析 参照Charles[10]的方法略有改动,采用TA.XT.plus质构分析仪对样品的质构进行分析。具体如下,先将凝胶样品装入直径为45mm、高55mm的烧杯中,样品高度为30mm,然后用25mm直径的平底探头对胶体进行挤压测定。探头的测试速度为1mm/s,下降距离为10mm。利用仪器自带的软件分析得到凝胶的相关质构参数:黏附性(取绝对值)、硬度、弹性。实验测定每个指标重复3次,取平均值。
1.2.3 凝胶持水度的测定 凝胶的持水性计算公式如下所示[11]。准确称取适量凝胶样品置于10mL离心管中离心30min,转速为4000r/min。
持水性(%)=(吸去水分后离心管质量(g)-离心管质量(g))/凝胶样品质量(g)×100
表1 响应曲面实验设计因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis
1.2.4 响应曲面实验 依据Box-Behnken设计原理,采用Design-Expert 8.00软件,选取体系pH、凝胶温度、酶与底物浓度比这3个因素在3个水平上进行响应曲面实验,其中响应值为凝胶的综合素质得分。共计17组实验,其中5个为中心点。
1.2.5 凝胶的综合素质评定 根据凝胶样品质量的指标内容,以及黏附性、硬度、弹性、持水度这四个因素对产品质量的重要程度的不同。先设定凝胶样品质量指标集U和权重向量A,然后计算凝胶的综合素质。凝胶质量指标集,其中u1、u2、u3、u4分别表示黏附性、硬度、弹性、持水度。
各因素的权重向量A=(a1,a2,a3,a4)=(0.3,0.3,0.3,0.1),并且a1+a2+a3+a4=1。
1.2.6 凝胶成品的粒径分析 粒径分布按Pan[12]所述方法进行测定,称取适量的凝胶配成2%溶液后搅拌1h,转速为200r/min,然后用粒径分布仪进行测定。
1.2.7 统计分析 采用SPSS 16.0软件分析各实验因素对凝胶性质的影响,采用LSD值对一维线性方差进行显著性分析,且当p<0.05时为显著。
图1 pH对凝胶时间和持水性,凝胶质构性质的影响Fig.1 Effect of pH on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.1 pH对凝胶效果的影响 由图1可知,随着pH逐渐升高,凝胶时间逐渐变长;持水性先上升后下降,在pH为7.5时达到最高(p<0.05),为84.7%;同时,凝胶的黏附性、硬度和弹性都呈下降趋势。这可能因为pH在6~8这个区间内,随着体系的pH不断变大,中性蛋白酶的活性逐渐变低,导致其对乳清蛋白酶解作用的功效降低;凝胶速度会变慢,其结构也会随之变得更有规则,不会呈杂乱无章的聚集状态,故而持水性变高、黏附性、硬度和弹性均降低[12]。但是,过高pH是会影响凝胶的色泽、降低其风味;况且太长凝胶时间也是不合适的。
2.1.2 凝胶温度对凝胶效果的影响 由图2可知,随着温度的升高,凝胶的硬度一直上升;而凝胶时间和凝胶的弹性都呈下降趋势;凝胶的持水性和黏附性表现为先上升后下降,当温度为45℃时两者均达到最大值(p<0.05),分别为85.6%和0.65。这表明随着温度的升高,中性蛋白酶的活性增强,对乳清蛋白的降解过程加快,进而凝胶时间变短。实验过程中还发现,在45℃时形成的凝胶质地不但结构均匀细腻,颜色上也是充满光泽。在45~55℃这个温度区间内,由于温度的持续上升可能导致了体系形成热诱导凝胶,从而促使凝胶的硬度增大、弹性减小、黏附性开始下降。
图2 凝胶温度对凝胶时间和持水性,凝胶质构性质的影响Fig.2 Effect of temperature on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.3 黄原胶添加量对凝胶效果的影响 由图3可知,随着黄原胶添加量的增多,凝胶速度加快、凝胶时间变短;凝胶的持水性、硬度、粘附性、弹性都近似呈线性上升趋势。这表明在0~0.02%范围内,随着黄原胶量的增多,凝胶的质构性质和持水性均向有利态势发展。这可能与黄原胶的性质有关,黄原胶是一种水溶性高分子多糖。一方面,由于其分子量大,溶于水后会充分水化而束缚了大量的自由水;另一方面,它的大体积分子也会和介质发生相互作用,阻碍介质的自由移动。所以,体系的层流间就会产生阻力阻碍其流动性,因而体系的黏附性会升高[13]。但是黄原胶的添加量也不宜太多,在实验过程中发现添加过多黄原胶后,凝胶的组织粗糙、质地坚硬,这对凝胶也是不利的。因此,黄原胶的量定为0.015%。
图3 黄原胶添加量对凝胶时间和持水性,凝胶质构性质的影响Fig.3 Effect of xanthan gum on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
图4 酶与底物浓度比对凝胶时间和持水性,凝胶质构性质的影响Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on gelling time,water holding capacity,and textural properties of the gel
2.1.4 不同酶与底物浓度比对凝胶效果的影响 如图4所示,随着酶与底物浓度比的上升,凝胶时间、黏附性、硬度呈逐渐下降趋势;凝胶弹性先下降后又上升,在酶与底物浓度比为1%时弹性最低(p<0.05),为0.93;持水性呈波浪形变化趋势,先升高后降低、然后又升高再降低。这表明随着酶的含量上升,酶解反应速率加快,凝胶时间变短;一般来说,不断加快的凝胶速度会导致凝胶结构变得不规则,呈现出杂乱无章的聚集状态,凝胶的黏附性、硬度和弹性也会随之上升[12]。但是在实验中凝胶的黏附性、硬度均呈下降趋势,持水性也呈特殊的变化趋势、分别在0.5%和1.0%这两个点达到较高值(p<0.05)。这些特殊的凝胶性质可能是由于在成胶点时的水解程度、聚集颗粒的特性不同[14]。
根据凝胶质量各个指标所占的权重不同,采用公式Y=A×U计算Box-Behnken实验中17个实验组的凝胶综合素质。其中,每个实验组的对应数据如下。
相应的Y1=(0.3,0.3,0.3,0.1)×,同理可得Y2,Y3,Y4,Y5·……Y17。
Box-Behnken实验设计及结果如表2所示。对数据进行二元多次回归分析,得到拟合方程为Y=0.1652A+ 0.02547B+0.5658C-0.0002AB-0.048AC-0.0098A2-0.000258B2-0.1592C2(其中BC项的系数为3.816×10-18,因此可以忽略不计),此时模型的p值为0.0239,小于0.05,即模型显著;模型的Lack of Fit的p值为0.7318,大于0.05。这说明拟合方程的拟合效果良好,能够满足响应面分析的要求。
表2 Box-Behnken实验结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results
根据表3,模型中只有A为极显著、C2为显著;其余项均不显著;三个因素对凝胶效果的影响依次为A>B>C,相应的pH>凝胶温度>酶与底物浓度比。
依据上面的分析,三个交互项均不显著,说明三者之间都没有相互的影响。图5列出了响应面的三维图。通过Design-Expert 8.00软件分析得到凝胶综合素质最高可达到0.721,此时的各因素的工艺条件为:pH6.5、凝胶温度46.8℃、酶与底物浓度比0.8%。
表3 回归模型系数显著性检验Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for response surface reduced quadratic model
采用优化后的实验条件进行重复实验,为了方便,参数定为pH6.5、凝胶温度47℃、酶与底物浓度比0.8%。最后所得Y值为0.720,与理论值0.721非常接近,可见所确定的模型能够较好地预测实验结果。
图5 各相互因素对凝胶综合得分影响的响应曲面图Fig.5 Effect of two factors on Y value by response surface analysis
通过对参数分别为pH6.5、凝胶温度47℃、酶与底物浓度比0.8%、黄原胶0.015%的凝胶的质构、持水性和粒径分析可以得到,凝胶的黏附性、硬度、弹性分别为0.72N·S、0.35N、0.94,与参考奶油比较接近(见表4,其中参考奶油的质构值按1.2.2中所述方法测定);持水度为83.3%,凝胶的平均粒径为22.63μm。由于凝胶颗粒细小均匀,因此可以用来模拟脂肪。
表4 凝胶和参考奶油的质构值Table 4 Textural properties of gel and reference cream
通过对凝胶条件单因素实验和Box-Behnken实验,结合响应曲面分析,建立起了凝胶参数的二次多项式模型。经过实验证明通过响应曲面确定的该模型是合理的,能够较好地预测凝胶的综合性质。通过模型分析和实验修正后得到的最佳参数:pH6.5、凝胶温度47℃、酶与底物浓度比0.8%、氯化钙2mmol/L、黄原胶0.015%。该条件下所制备的凝胶的综合素质为0.720,色泽乳黄、质构指标和脂肪比较接近。
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